孫瑩慧,夏 葉,陳鵬飛,繆德年

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,上海 201106)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種小型無包膜病毒,屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,為單鏈環(huán)狀DNA 病毒。 PCV 基因組長度為1 700—2 000 bp,其中PCV1 基因組為1 759 bp,PCV2 基因組為1 767 bp 或1 768 bp,PCV3 基因組為2 000 bp。 PCV1、PCV2 和PCV3 均包含開放閱讀框1(ORF1)和開放閱讀框2(ORF2),其中ORF1 閱讀框編碼的Rep 蛋白與病毒復(fù)制密切相關(guān),ORF2 編碼的Cap 蛋白參與病毒吸附、入侵、脫殼及組裝成新病毒粒子等全過程,同時(shí)Cap 蛋白作為病毒衣殼組分,是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要保護(hù)性抗原。 當(dāng)豬只被PCV 病毒感染時(shí),血清中可檢測出針對Rep 蛋白的抗體,而用PCV的滅活疫苗或亞單位疫苗免疫豬只后,不產(chǎn)生針對PCV Rep 蛋白的抗體[ 1]。 在臨床應(yīng)用時(shí),Rep 蛋白主要作為鑒別PCV 感染的候選診斷抗原,Cap 蛋白是PCV 亞單位疫苗的候選抗原[ 2]。

2015 年以前,PCV1 和PCV2 已被報(bào)道,其中PCV2 可導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天震顫(CT)、呼吸道疾病綜合征(PRDC)等[ 3]。 2016 年,在美國患有多系統(tǒng)疾病的豬群中首次發(fā)現(xiàn)PCV3,PCV3 也可導(dǎo)致生殖衰竭、豬皮炎和腎病綜合征[ 4]。 2016 年底,我國在廣東及廣西的豬群中檢出PCV3[ 5]。 對PCV2 和PCV3 基因組序列分析發(fā)現(xiàn),PCV2 目前可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 等不同的基因亞型,其中PCV2b 和PCV2d 基因亞型的毒力明顯高于PCV2a。 PCV3 基因亞型可分為PCV3a、PCV3b 和PCV3c。 PCV2 與PCV3 的基因組相比,兩者開放閱讀框的遺傳距離較遠(yuǎn),且PCV2 與PCV3 的抗原表位不具備同源性,故現(xiàn)有PCV2 商品化疫苗無法對感染PCV3的豬群提供交叉免疫保護(hù)[ 6]。 當(dāng)前,我國豬群中PCV2 和PCV3 混合感染現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[ 7],為了解臨床疑似豬圓環(huán)病毒患病豬的混合感染情況,本研究對疑似PCV 感染的樣品進(jìn)行流行情況調(diào)查及其遺傳進(jìn)化分析,以期為豬圓環(huán)病毒病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及主要試劑

2020—2021 年從江蘇省南通、江陰及山東省濟(jì)寧等地規(guī)?；B(yǎng)豬場中采集疑似感染PCV 的豬肺臟、淋巴結(jié)等樣品,共獲得10 份樣品,其中育肥豬5 份、哺乳仔豬3 份、保育豬1 份、流產(chǎn)死胎1 份。

豬圓環(huán)病毒PCR 檢測試劑盒、豬圓環(huán)病毒3 型PCR 檢測試劑盒購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司;DL-5000 DNA Marker、PrimeSTAR?HS(Premix)購自TaKaRa 公司;病毒基因組DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、pLB 零背景快速克隆試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司;DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 PCV 檢測

取適量的組織樣品置于離心管中,加入適量MEM,研磨成勻漿,反復(fù)凍融3 次,10 000 r∕min 離心10 min,收集上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后分裝。 按照病毒基因組DNA 提取試劑盒說明書步驟提取病毒DNA。 根據(jù)PCR 檢測試劑盒說明書對10 份病料依次進(jìn)行PCV1、PCV2 和PCV3 檢測,預(yù)期目的條帶大小依次為652 bp、1 154 bp 和329 bp。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,62 ℃退火45 s 或55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。 反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.3 PCV2 和PCV3 全基因組序列擴(kuò)增與測序

參照GenBank 登錄的PCV2 和PCV3 全基因組序列,設(shè)計(jì)PCV2 和PCV3 全基因組擴(kuò)增引物,PCV2 為(F: 5′-ATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTT-3′∕R: 5′-GTGGATTGTTCTGTAGCATTCTTCCA-3′), PCV3 為(F:5′-GCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3′∕R:5′-AAATTTCTGACAAACGTTACA-3′)。 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 PCR 反應(yīng)體系為模板4 μL,上下游引物各2 μL(10 μm∕μL),Premix 25 μL,補(bǔ)水至50 μL。 PCR 程序?yàn)?8 ℃2 min;98 ℃10 s,60 ℃退火5 s,72 ℃退火2 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃退火5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。 采用膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物,將其連接至pLB 載體后轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,再接種至含氨芐青霉素抗性的LB 培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h。 挑取單菌落培養(yǎng)后,取鑒定為陽性的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 PCV2 和PCV3 全基因組序列分析

通過Megalign 軟件中Clustal W 方法將分離株的全基因組序列與GenBank 登錄的部分PCV2 和PCV3全長序列進(jìn)行同源性分析,并利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 利用MegAlign 軟件對PCV2 Cap 蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析。 利用Jameson-wolf 方法對分離株Cap 蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV 檢測

由圖1 可知,PCV1 擴(kuò)增片段約652 bp,10 份病料均為陰性;PCV2 擴(kuò)增片段約1 154 bp,檢出率為90%;PCV3 擴(kuò)增條帶為329 bp,檢出率為30%;PCV2 和PCV3 混合感染率為30%,感染個(gè)體為哺乳仔豬和流產(chǎn)死胎。 綜上,2020—2021 年引起江蘇及山東部分地區(qū)豬場發(fā)生疑似豬圓環(huán)病毒病的病原主要是PCV2,其次是PCV3,且存在一定比例的PCV2 與PCV3 混合感染情況。

圖1 PCV1、PCV2、PCV3 電泳檢測Fig.1 Detection of PCV1,PCV2 and PCV3 in diseased samples by agarose gel electrophoresis

2.2 PCV2 和PCV3 全基因組序列擴(kuò)增與測序

利用全基因組擴(kuò)增引物對陽性樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,將膠回收產(chǎn)物克隆至pLB 載體并測序分析,結(jié)果顯示,毒株中有6 株P(guān)CV2 全基因組長度為1 767 bp,3 株P(guān)CV2 基因組全長為1 768 bp,3 株P(guān)CV3 全長為2 000 bp(表1)。

表1 毒株序列信息Table 1 Information of PCV2 and PCV3 isolated strains

2.3 PCV2 和PCV3 毒株的全基因組序列分析

2.3.1 PCV2 毒株的全基因組的同源性與進(jìn)化樹分析

參照GenBank 登錄的20 株國內(nèi)外PCV2 全基因組序列,對獲得的9 株P(guān)CV2 毒株序列進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。 結(jié)果顯示,這9 株P(guān)CV2 毒株之間的全核苷酸序列同源性為94.5%—100.0%,毒株間同源性最高的是2020 年采集的江蘇毒株(20JS-7)與2021 年采集的山東毒株(21sd-2),為100.0%,表明兩者為同一毒株。 9 株P(guān)CV2 毒株與國內(nèi)外20 株參考株的同源性為93.4%—99.8%。 進(jìn)化樹結(jié)果顯示,9 株P(guān)CV2 毒株基因型分別為PCV2d(5 株)、PCV2b(2 株)、PCV2a(1 株)和PCV2e(1 株)。20JS-10、21JS-3、21JS-10、20JS-7、21sd-2 均屬于PCV2d 型,且主要與國內(nèi)山東株(MF326373.1)、江蘇株(JX982222.1)、湖南株(MH718995.1)的親緣關(guān)系較近。 21JS-8 與20JS-6 同屬于PCV2b 型。 21JS-9 為PCV2a 型,與湖北毒株(FJ870968.1)和上海毒株(KF850466.1)遺傳關(guān)系近。 21JS-6 屬于PCV2e 型(圖2)。 綜上,9 株P(guān)CV2 毒株之間有較高的核苷酸序列同源性,PCV2 毒株的優(yōu)勢基因型為PCV2d 型,其次是PCV2b 型,并伴有PCV2a 和PCV2e 型低頻發(fā)生。

圖2 PCV2 毒株的全基因組序列進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the full genomes of the PCV2 isolated strains

2.3.2 PCV3 毒株的生物信息學(xué)分析

對3 株P(guān)CV3 毒株進(jìn)行全基因組序列同源性分析及遺傳進(jìn)化樹繪制。 結(jié)果顯示,3 株P(guān)CV3 毒株全長序列之間的核苷酸同源性為99.2%—99.8%,與18 株參考株間同源性為98.6%—100%。 序列進(jìn)化樹結(jié)果顯示,3 株P(guān)CV3 毒株基因型為PCV3a(2 株)與PCV3b(1 株),其中21V3-8 毒株與中國湖南毒株(MW883 348.1)屬于同一分支,21V3-7 毒株與中國廣東毒株(MH491028.1)處于同一分支,21V3-10 與國外毒株(MW167067.1)親緣關(guān)系較近(圖3)。 綜上,分離出的PCV3 毒株的全基因序列相似性較高,遺傳距離較近。

圖3 PCV3 毒株全基因組序列進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the PCV3 strains

2.4 PCV2 和PCV3 毒株的Cap 蛋白氨基酸序列比對

Cap 蛋白氨基酸序列分析結(jié)果顯示,9 株P(guān)CV2 毒株與3 株P(guān)CV3 毒株的親緣性較遠(yuǎn),氨基酸同源性僅為43.9%—45.1%。 本研究鑒定的9 株P(guān)CV2 毒株ORF2 編碼的Cap 蛋白氨基酸位點(diǎn)存在多處突變,主要集中在aa53、aa68、aa134、aa190—aa210 區(qū)域。 優(yōu)勢基因型PCV2d 毒株Cap 蛋白在aa50—aa70、aa150—aa170 區(qū)域,抗原指數(shù)均明顯高于3 個(gè)疫苗株。 其余PCV2a、PCV2b 和PCV2e 型的部分氨基酸位點(diǎn)也存在抗原指數(shù)升高現(xiàn)象(圖4)。 與PCV3 參考株序列相比,本研究鑒定的3 株P(guān)CV3 毒株除24 與97位氨基酸發(fā)生突變外,其余氨基酸位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)變異,其Cap 蛋白抗原指數(shù)也與參考毒株差異較小。 綜上,江蘇及山東部分地區(qū)PCV2 毒株的Cap 蛋白氨基酸序列變異程度大且抗原指數(shù)較高,而PCV3 毒株的Cap蛋白氨基酸序列相對保守。

圖4 PCV2 毒株Cap 蛋白抗原指數(shù)Fig.4 Cap protein antigenic index of PCV2 isolated strains

3 討論

PCV2 和PCV3 混合感染母豬后可引起卵巢病理損傷,造成患病母豬卵泡細(xì)胞數(shù)量減少,卵母細(xì)胞細(xì)胞核皺縮,卵泡腔塌陷扁平,導(dǎo)致其無法正常排卵,最終引起母豬屢配不孕的現(xiàn)象,對我國養(yǎng)殖業(yè)的危害較大[ 8]。 姜子昕[ 9]調(diào)查發(fā)現(xiàn),2019—2020 年山東省內(nèi)各地屠宰場、養(yǎng)殖場和無害化處理廠中豬組織樣品中PCV2 和PCV3 混合感染率為0.43%(8∕186 5)。 牟泓曄等[ 10]2022 年對浙江省181 份豬肌肉及全血樣品進(jìn)行PCV 檢測,發(fā)現(xiàn)PCV2 和PCV3 混合感染陽性檢出率為11.6%(21∕181)。 與上述學(xué)者的研究結(jié)果一致,本研究中也存在PCV2 和PCV3 混合感染,混合感染陽性率為30%,病料樣品來自哺乳仔豬和流產(chǎn)死胎,這是否提示PCV2 和PCV3 可通過母豬先天性胎盤垂直感染,或者仔豬后天性被病毒感染,還有待進(jìn)一步研究。

PCV2 基因型具有多樣性,Xu 等[ 11]研究2018—2020 年我國PCV2 基因型流行病學(xué)結(jié)果表明,PCV2d型陽性率為47%,PCV2b 陽性率為29%,PCV2d 和PCV2b 為優(yōu)勢基因型。 本研究所獲得的9 株P(guān)CV2 毒株也是以PCV2d 亞型流行為主,PCV2b 亞型次之,提示江蘇及山東部分地區(qū)規(guī)?；i場需重點(diǎn)關(guān)注PCV2b 和PCV2d 型的圓環(huán)病毒病防控。 本研究獲得的PCV3 毒株全基因組序列與國內(nèi)外部分參考株的同源性達(dá)98.6%—100%,Jia 等[ 12]研究表明,河南PCV3 分離株的核苷酸序列較參考菌株也表現(xiàn)出大于98%的高度同源性,本研究結(jié)果與之類似。 PCV2 Cap 蛋白氨基酸序列存在Y8thF、86SNPRSV91、190T191G206I等多處位點(diǎn)突變,而PCV3 毒株只有A24V、R27K 和E128D 等個(gè)別位點(diǎn)表現(xiàn)出差異[ 13-15]。 本試驗(yàn)獲得的PCV3 毒株的氨基酸變異程度較小,保守性較高,而PCV2 毒株Cap 蛋白氨基酸位點(diǎn)呈現(xiàn)多處的散在性突變,其抗原指數(shù)與當(dāng)前PCV2 疫苗株Cap 蛋白相比差異較大,其中部分PCV2 毒株共存在6 處抗原指數(shù)明顯高于疫苗株,提示當(dāng)前臨床上PCV2 疫苗可能免疫效果不理想。 另外,PCV3 毒株與PCV2 毒株的Cap蛋白氨基酸同源性僅為43.9%—45.1%,提示需研制針對PCV3 毒株的疫苗。

本研究結(jié)果表明,臨床上PCV2 感染豬中有部分個(gè)體存在與PCV3 混合感染的現(xiàn)象,而PCV2 與PCV3混合感染是如何引發(fā)機(jī)體致病及其對生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)的影響有待進(jìn)一步研究。