刁倩楠,曹燕燕,姚東偉,許 爽,陸世鈞,郁勤飛,張永平*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海 201403;2 浙江施特葆生物科技有限公司,杭州 310000)

低溫作為影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因素之一,會引起葉片黃化、病變和坐果率下降,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)降低[ 1-2]。 甜瓜(Cumumis meloL.)是一種世界性的經(jīng)濟(jì)作物,在中國的栽培歷史已經(jīng)超過3 000 年。甜瓜喜溫耐熱,生育期適溫為25—35 ℃,幼苗期適溫為20—25 ℃[ 3],在冬春季栽培過程中經(jīng)常遭遇低溫脅迫,嚴(yán)重影響甜瓜生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。 低溫脅迫會引起植物體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的大量積累,導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷[ 4-5]。 植物通過激活防御系統(tǒng)清除ROS,其中酶促防御系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR);非酶促防御系統(tǒng)主要包括谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(ASA)等[ 6]。

一氧化氮(NO)是一種具有生物活性的氣體分子,參與調(diào)節(jié)種子萌發(fā)、根系生長、氣孔關(guān)閉、開花及衰老等多種生理過程[ 7],還能參與抵御各種病原體、極端溫度、干旱、鹽害等各種生物與非生物脅迫[ 8-9]。 大量研究表明,NO 能通過維持葉綠體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及增強抗氧化防御能力,清除ROS 的積累,誘導(dǎo)脅迫相關(guān)蛋白基因的表達(dá),從而提高植物對逆境脅迫的耐受性[ 10-15]。 另外,NO 還能與其他激素、信號分子(鈣離子、谷胱甘肽和ROS 等)相互作用來調(diào)控植物抗逆防御反應(yīng)[ 8]。

鈣(Ca)是植物體內(nèi)一種必需的營養(yǎng)元素,鈣離子(Ca2+)是維持植物細(xì)胞正常生長代謝的重要離子[ 16],也是細(xì)胞內(nèi)的第二信使,對于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)具有重要作用[ 17]。 當(dāng)植物受到外界環(huán)境刺激時,會引起Ca2+濃度發(fā)生變化,從而產(chǎn)生抗性響應(yīng)[ 18-21]。 外源添加適宜濃度的Ca2+能提高植物對機械損傷、干旱、重金屬、高溫、低溫和鹽脅迫等逆境的抵抗能力[ 22-26]。 在植物的逆境反應(yīng)中,Ca2+信號可以與其他信號分子結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)[ 27-28]。 如NO、過氧化氫(H2O2)和Ca2+參與ABA 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉[ 29]。 Arasimowicz 等[ 30]研究顯示,NO 通過環(huán)鳥苷酸(cGMP)和環(huán)狀-ADP-核糖(cADPR)激活鹽脅迫下Ca2+通道,增加胞內(nèi)Ca2+的含量。 Liao 等[ 31]和李春蘭等[ 32]研究發(fā)現(xiàn),外施NO 可以通過提高Ca2+水平促進(jìn)萬壽菊和黃瓜外植體不定根的形成。 此外,蠟燭果中的NO 可能與Ca2+存在信號互作效應(yīng),通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜Na+∕H+反向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)抵御鹽脅迫帶來的傷害[ 33]。 外源NO 可以通過提高胞質(zhì)Ca2+濃度,增強紫花苜蓿種子的抗干旱能力[ 34]。 可見,NO 和Ca2+可以多種形式參與植物的抗逆反應(yīng),并存在復(fù)雜的關(guān)聯(lián)性,但二者在甜瓜對低溫脅迫中的響應(yīng)關(guān)系尚不明確。 本研究通過外源施用NO 供體硝普鈉(SNP)、氯化鈣(CaCl2)及清除劑的方法,研究低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中Ca2+含量、ROS 產(chǎn)生及抗氧化系統(tǒng)的變化,旨在探明Ca2+在NO 誘導(dǎo)甜瓜耐冷性生理機制中的作用,為作物抗逆研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試甜瓜品種為‘XL-1’(低溫敏感型),種子由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所提供,試驗在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所進(jìn)行。 2020 年7 月13 日將飽滿、整齊一致的種子浸種催芽,露白后播于裝有西甜瓜專用育苗基質(zhì)的塑料營養(yǎng)缽中,置于晝(28 ±1)℃∕夜(22 ±1)℃培養(yǎng)室中進(jìn)行幼苗培養(yǎng),光照12 h,光照強度為32 000 lx 左右,幼苗長至3 葉1 心時,選取長勢一致的甜瓜植株進(jìn)行試驗。

SNP、CaCl2、Hb(血紅蛋白,NO 清除劑)、EGTA(乙二醇四乙酸,游離Ca2+螯合劑)、TFP(三氟拉嗪,鈣調(diào)素CaM 活性抑制劑)、LaCl3(三氯化鑭,質(zhì)膜Ca2+通道阻斷劑)均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

為研究低溫脅迫下外源SNP 處理是否能誘導(dǎo)甜瓜幼苗葉片中Ca2+的產(chǎn)生,試驗設(shè)置3 個處理:蒸餾水(H2O)、200 μmol∕L 硝普鈉(SNP,NO 供體)、0.1%血紅蛋白(Hb,NO 清除劑),以葉片正反面全部浸濕且不形成液滴為宜,連續(xù)噴施3 d,然后置于10 ℃∕6 ℃下處理24 h 后取樣測定相關(guān)指標(biāo),以常溫下噴施H2O 作為對照(CK)。

為研究低溫脅迫下Ca2+能否參與到NO 誘導(dǎo)的甜瓜幼苗耐低溫性,試驗設(shè)置7 個處理(表1),甜瓜幼苗葉片正反面均勻噴施處理試劑,以常溫下噴施H2O 作為對照(CK)。 其中T4、T5、T6 和T7 處理中,5 mmol∕L EGTA、100 μmol∕L TFP、50 μmol∕L LaCl3作為預(yù)處理,12 h 后進(jìn)行200 μmol∕L SNP 和5 mmol∕L CaCl2處理,然后在10 ℃∕6 ℃下低溫處理24 h。 從每個處理中選取第3 片完全展開葉片,將葉片樣品冷凍在液氮中,并在-80 ℃下保存待用。 每個處理50 株,重復(fù)3 次。

表1 試驗不同處理Table 1 Treatments in the test

1.3 測定項目與方法

1.3.1 鈣離子含量測定

將甜瓜葉片樣品在105 ℃下殺青,然后65 ℃烘干至恒重。 稱取干樣0.5 g 于聚四氟乙烯消解罐內(nèi),加硝酸5 mL 浸泡過夜。 蓋好內(nèi)蓋,旋緊不銹鋼外套,放入恒溫干燥箱,80 ℃保持1—2 h,120 ℃保持1—2 h,再升至160 ℃保持4 h,在箱內(nèi)自然冷卻至室溫,打開后加熱趕酸至近干,將消化液洗入25 mL 容量瓶中,用少量硝酸溶液(1%)洗滌內(nèi)罐和內(nèi)蓋3 次,洗液合并至容量瓶中并用1%硝酸定容,混勻備用。 同時設(shè)置試劑空白試驗。 試液上機測定鈣離子含量(賽默飛電感耦合等離子發(fā)射光譜儀iCAP 7200 HS Duo)。

1.3.2 生理生化特性測定

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定;過氧化氫(H2O2)含量參照Patterson 等[ 35]的方法測定;超氧陰離子(O2-)產(chǎn)生速率參照Elstner 等[ 36]的方法測定;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性參照陳建勛等[ 37]的方法測定;抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性參照Nakano 等[ 38]的方法測定;脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性參照Schaedle 等[ 39]的方法測定;抗壞血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量參照Cakmak等[ 40]的方法測定。 每個指標(biāo)測定重復(fù)3 次,取平均值。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 軟件繪圖,采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO 對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中鈣離子含量的影響

由圖1 可知,與對照(CK)相比,低溫處理(H2O)誘導(dǎo)甜瓜葉片中鈣離子含量升高了40.86%。 在低溫處理下外源噴施SNP 可進(jìn)一步提高鈣離子含量,比CK和低溫處理(H2O)分別增加了84.27% 和30.82%。而Hb 處理后,鈣離子含量增幅有所減少,比CK 高55.30%。 可見,低溫脅迫下外源NO 可以上調(diào)甜瓜幼苗葉片中鈣離子的水平。

圖1 外源NO 和NO 清除劑Hb 對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中鈣離子含量的影響Fig.1 Effects of exogenous NO and NO scavenger Hb on Ca2+content in melon seedling leaves under low temperature stress

2.2 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖2 可以看出,與對照(CK)相比,低溫處理(T1)的甜瓜幼苗葉片中SOD、POD 和CAT 活性分別增加了8.71%、16.86%和46.10%。 低溫處理下外源噴施CaCl2和SNP 進(jìn)一步提高了SOD、POD 和CAT 的活性,SNP 處理(T3)的甜瓜葉片中SOD、POD 和CAT 活性分別比T1 處理增加了30.78%、9.31% 和31.82%。 施用EGTA(T4)、TPF(T5)和LaCl3(T6)預(yù)處理后,SOD、POD 和CAT 活性明顯低于單獨SNP 處理(T3),其中T4 處理的SOD、POD 和CAT 活性分別比T3 處理降低了25.66%、56.66%和51.93%。 與CaCl2處理(T2)相比,CaCl2+Hb(T7)處理的SOD、POD 和CAT 活性無顯著變化。

圖2 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中SOD、POD 和CAT 活性的影響Fig.2 Effects of NO and Ca2+ on the activities of SOD,POD and CAT in melon seedling leaves under low temperature stress

2.3 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中MDA、H2O2 含量和O2-產(chǎn)生速率的影響

由圖3 可知,與CK 相比,低溫處理(T1)后,MDA、H2O2含量及O2-的產(chǎn)生速率均顯著升高,分別是CK 的2.01 倍、1.31 倍和4.84 倍。 與低溫處理(T1)相比,外源CaCl2(T2)和SNP(T3)處理降低了甜瓜幼苗葉片中的MDA、H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率,分別較T1 降低了42.39%和35.04%、52.77%和63.62%、59.83%和67.72%。 添加外源SNP 的同時施用EGTA(T4)、TPF(T5)和LaCl3(T6)處理后,MDA 和H2O2含量、O2-產(chǎn)生速率均有不同程度增加。 而CaCl2+Hb 處理(T7)與單獨CaCl2處理(T3)相比差異不顯著。 以上結(jié)果說明,低溫脅迫提高了甜瓜幼苗葉片中ROS 的產(chǎn)生,外源NO 能有效清除ROS,此過程中有Ca2+的參與。

圖3 外源NO和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中H2O2、MDA含量和O2-產(chǎn)生速率的影響Fig.3 EffectsofNOand Ca2+onthecontent of H2O2,MDAandO2-productionrate in melon seedling leaves under low temperature stress

2.4 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中ASA-GSH 循環(huán)的影響

由圖4 可以看出,在低溫脅迫下,甜瓜幼苗葉片中的GSH 含量、GSH∕GSSG 和ASA∕DHA 低于對照,ASA 含量在低溫處理后略高于對照。 與單獨低溫(T1)處理相比,低溫脅迫下噴施CaCl2(T2)顯著提高了GSH 含量、GSH∕GSSG、ASA 含量和ASA∕DHA,增幅分別達(dá)4.89 倍、1.53 倍、0.99 倍和0.57 倍。 外源SNP處理的ASA 和GSH 含量、ASA∕DHA 和GSH∕GSSG 也明顯提高。 與SNP 處理(T3)相比,SNP + EGTA(T4)、SNP+ TPF(T5)和SNP + LaCl3(T6)處理的ASA 和GSH 含量、ASA∕DHA 和GSH∕GSSG 均顯著下降。 T4 處理的GSH 含量、GSH∕GSSG、ASA 含量及ASA∕DHA 分別比T3 處理降低了88.24%、84.80%、62.91%和30.06%。 CaCl2+Hb 處理(T7)的GSH 含量、GSH∕GSSG、ASA 含量及ASA∕DHA 與CaCl2處理(T2)相比差異不明顯。 綜上,葉片噴施SNP 能夠提高低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中的ASA 含量、ASA∕DHA、GSH 含量和GSH∕GSSG,緩解低溫脅迫造成的傷害。 此外,Ca2+參與到外源NO 對低溫脅迫下ASAGSH 組分的影響。

圖4 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中GSH 和ASA 含量、GSH∕GSSG 和ASA∕DHA 的影響Fig.4 Effects of NO and Ca2+ on the content of GSH and ASA,GSH∕GSSG and ASA∕DHA in melon seedling leaves under low temperature stress

2.5 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中ASA-GSH 循環(huán)相關(guān)酶活性的影響

如圖5 所示,經(jīng)過低溫脅迫處理后,甜瓜幼苗葉片中的GR、DHAR 和MDHAR 活性低于對照。 外源噴施CaCl2(T2 處理)顯著提高了APX、GR、DHAR 和MDHAR 的活性,分別比低溫處理(T1)提高了25.30%、23.60%、54.55%和49.35%。 低溫脅迫下施用SNP(T3)也能顯著提高甜瓜幼苗葉片中APX、GR、DHAR 和MDHAR 的活性,與低溫處理(T1)相比,增幅分別為46.36%、16.18%、86.36%和63.64%。低溫下施用EGTA(T4 處理)、TFP(T5 處理)和LaCL3(T6 處理)能明顯抑制NO 的誘導(dǎo)作用,LaCl3處理(T6)后APX、GR、DHAR 和MDHAR 的活性分別比T3 處理降低了61.35%、45.45%、63.41%和54.76%。當(dāng)添加NO 清除劑Hb(T7 處理)后對CaCl2的作用沒有明顯影響。 以上結(jié)果說明,Ca2+參與了NO 對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中ASA-GSH 循環(huán)相關(guān)酶的影響。

圖5 外源NO 和Ca2+對低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中ASA-GSH 循環(huán)相關(guān)酶活性的影響Fig.5 Effects of NO and Ca2+ on ASA-GSH cycle related enzyme activities in melon seedling leaves under low temperature stress

3 討論

低溫作為非生物脅迫之一,能通過一系列形態(tài)、生理生化和分子過程限制熱帶及亞熱帶植物的生長發(fā)育[ 41]。 因此,低溫脅迫是影響冷敏感作物甜瓜栽培的主要因素。 前人研究證明,外源NO 和Ca2+均可緩解鹽分、干旱等逆境脅迫的傷害[ 8]。 本研究中,低溫脅迫下外源SNP 能夠誘導(dǎo)Ca2+的積累,而Hb 處理后Ca2+增加的幅度明顯減小,表明低溫脅迫下外源NO 能夠上調(diào)甜瓜幼苗葉片中Ca2+的水平。 這在紫花苜蓿、黃瓜和玉米上也得到證明[ 34,42-43]。 然而,Garcia-Mata 等[ 29]在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),Ca2+能夠通過誘導(dǎo)一氧化氮合酶(NOS)活性刺激NO 的產(chǎn)生;在高羊茅草[ 44]和小麥[ 45]的研究中也發(fā)現(xiàn),外源Ca2+能夠顯著增加葉片中的NO 含量。 因此,NO 與Ca2+之間的相互關(guān)系可能因作物和脅迫條件的不同而產(chǎn)生不同的作用。

低溫脅迫可造成植物體內(nèi)ROS 的過度積累,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化程度和細(xì)胞膜透性增大,從而產(chǎn)生氧化脅迫。 MDA 具有毒害作用,可以加劇膜損傷[ 46]。 本研究中,低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片中H2O2、MDA含量以及O2-產(chǎn)生速率增加,外源噴施CaCl2和SNP 可顯著抑制甜瓜幼苗葉片中ROS 的積累,降低低溫對甜瓜幼苗的負(fù)面影響,這與在小麥、芥菜和黃瓜中的研究結(jié)果一致[ 47-49]。 本研究在添加外源NO 的同時施用Ca2+螯合劑EGTA、鈣調(diào)素CaM 活性抑制劑TPF、Ca2+通道抑制劑LaCl3進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)與單獨SNP處理相比,EGTA、TFP 和LaCl3處理后ROS 的產(chǎn)生增多,表明Ca2+在NO 誘導(dǎo)的甜瓜幼苗抗冷性中具有重要作用。 Chen 等[ 50]研究表明,Ca2+參與NO 和生長素誘導(dǎo)的側(cè)根形成。 Ma 等[ 51]報道,NO 激活的鈣∕鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CCaMK)能夠調(diào)節(jié)玉米ABA 誘導(dǎo)的抗氧化防御反應(yīng)。 綜上所述,外源SNP 處理能明顯緩解低溫對甜瓜幼苗的傷害,然而,在Ca2+通道阻滯劑、Ca2+螯合劑和鈣調(diào)素抑制劑存在下,NO 的作用被抑制,甜瓜幼苗葉片中產(chǎn)生了更多的ROS。

植物體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS 是低溫對植物造成傷害的主要原因,植物本身擁有清除機制來緩解脅迫引起的氧化傷害[ 52]。 SOD 作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,可以將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2,H2O2能夠被CAT直接分解為O2和H2O,POD 也能作為ROS 的有效清除劑發(fā)揮作用[ 53]。 本研究表明,外源NO 和CaCl2能增強SOD、POD 和CAT 的活性,從而降低ROS 的積累。 但外源NO 和CaCl2處理的CAT 活性降低,與Clark 等[ 54]研究類似,原因可能是由于NO 與血紅素中的鐵原子相互作用,形成硝?；F,從而抑制了CAT 活性。 另一方面,外源EGTA、TFP、LaCl3的應(yīng)用抑制了NO 對低溫脅迫下甜瓜幼苗的作用。 Tian等[ 55]研究表明,NO 和Ca2+均能減輕鹽脅迫對小麥幼苗產(chǎn)生的不利影響,且而外源NO 可以促進(jìn)Ca2+吸收和轉(zhuǎn)運。 以上結(jié)果說明,NO 通過誘導(dǎo)Ca2+激活抗氧化系統(tǒng),從而提高甜瓜幼苗的耐低溫性。

抗壞血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循環(huán)是植物體內(nèi)存在的一個重要抗氧化保護(hù)系統(tǒng),能夠維持植物體內(nèi)的氧化還原平衡,其中涉及的關(guān)鍵酶有APX、GR、DHAR、MDHAR 及其代謝物ASA 和GSH。 本研究中,低溫脅迫下噴施CaCl2和SNP 后,ASA 和GSH 含量、GSH∕GSSG、ASA∕DHA 明顯提高,EGTA、TFP、LaCl3顯著抑制了SNP 的誘導(dǎo)作用,說明Ca2+能參與NO 誘導(dǎo)的ASA 和GSH 含量提高。 類似的結(jié)果在黃瓜、小麥上也得到證明[ 56-57]。 另外,低溫下施用SNP 能顯著提高甜瓜幼苗葉片中APX、GR、DHAR 和MDHAR 的活性,而施用EGTA、TFP、LaCl3抑制了SNP 的誘導(dǎo)作用,表明Ca2+參與了NO 誘導(dǎo)的ASA-GSH 循環(huán)還原能力的改善。 除此之外,NO 和Ca2+與鹽和高溫脅迫響應(yīng)機制密切相關(guān)[ 58-59]。 目前認(rèn)為,NO 作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+動員化合物發(fā)揮作用,并且還可以通過植物中的多種途徑調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性[ 60]。

綜上所述,外源NO 通過降低ROS 的積累,提高抗氧化酶的活性來保護(hù)細(xì)胞膜免受傷害,從而增強甜瓜幼苗對低溫脅迫的耐受性。 此外,NO 可以誘導(dǎo)Ca2+的產(chǎn)生,Ca2+參與NO 誘導(dǎo)的APX、GR、DHAR 和MDHAR 活性增強。 NO 誘導(dǎo)的酶活性提高進(jìn)一步促進(jìn)了ASA、GSH 含量以及AsA∕DHA、GSH∕GSSG 的增加,從而減輕了甜瓜幼苗在低溫下的氧化損傷。 基于以上結(jié)果,本研究認(rèn)為,Ca2+參與NO 介導(dǎo)的甜瓜幼苗信號通路以響應(yīng)低溫脅迫。