張 丹,朱秋瑾,譚 琦,宋春艷,于海龍,王瑞娟,尚曉冬,劉建雨

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,上海 201403)

金針菇(Flammulina filiformis)學(xué)名毛柄金錢菌,又稱毛柄小火菇、構(gòu)菌、樸菇、冬菇、樸菰等,其口感脆嫩,營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛[ 1]。 金針菇是我國(guó)主要的栽培食用菌之一,近5 年的年產(chǎn)量維持在260 萬(wàn)t左右[ 2]。 菌種是金針菇生產(chǎn)的核心要素,菌種退化是產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)期關(guān)注的焦點(diǎn)。 菌種退化是食用菌的生物學(xué)特征之一,菌種具有的典型優(yōu)良性狀發(fā)生明顯弱化或喪失的現(xiàn)象稱為退化,這是一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演化過(guò)程。 菌種退化常表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)勢(shì)弱、基質(zhì)降解能力下降、抗性弱、子實(shí)體產(chǎn)量明顯下降等[ 3-4]。金針菇菌種具有生長(zhǎng)速率快、對(duì)培養(yǎng)環(huán)境敏感、易產(chǎn)生粉孢子等特性,生產(chǎn)用菌種較易發(fā)生菌種退化[ 5]。為了保持菌種的優(yōu)良性狀,對(duì)常用菌種進(jìn)行提純復(fù)壯是保證金針菇高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要措施之一。

常用的提純復(fù)壯方法有尖端菌絲分離、組織分離以及原生質(zhì)體再生等,其中原生質(zhì)體再生被認(rèn)為是提純復(fù)壯的較好方法,在雙孢蘑菇、白靈菇、平菇等食用菌上已有研究報(bào)道[ 6-8]。 原生質(zhì)體再生技術(shù)在金針菇的誘變育種、細(xì)胞融合育種、菌絲脫毒以及遺傳學(xué)分析等方面也有應(yīng)用[ 1,9-11]。 陳鵬等[ 12]對(duì)金針菇原生質(zhì)體制備及再生技術(shù)進(jìn)行了正交優(yōu)化,完善了金針菇原生質(zhì)體的制備方法。 在金針菇菌種復(fù)壯方面,鮮見有關(guān)原生質(zhì)體再生技術(shù)的應(yīng)用及遺傳機(jī)理的研究報(bào)道。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,廣泛分布于基因組的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)標(biāo)記被大量應(yīng)用于遺傳研究。 SNP 主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性,包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等[ 13]。 根據(jù)對(duì)生物遺傳性狀的影響,可將SNP 分為蛋白編碼SNP 和非蛋白編碼SNP[ 14]。 轉(zhuǎn)錄組是開發(fā)標(biāo)記的理想資源,基于轉(zhuǎn)錄組建立的標(biāo)記是根據(jù)基因的差異而建立的標(biāo)記,也稱為基因內(nèi)部標(biāo)記,除具有一般分子標(biāo)記的特點(diǎn)外,還有信息量大、通用性好等優(yōu)勢(shì)[ 15]。由于轉(zhuǎn)錄本保守性較高,如果發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因內(nèi)部標(biāo)記與某一性狀連鎖,那么該轉(zhuǎn)錄本就可能與控制該性狀的基因相關(guān)[ 16]。

本研究采用原生質(zhì)體再生技術(shù)對(duì)工廠化白色金針菇退化菌株進(jìn)行復(fù)壯,同時(shí)基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SNP 標(biāo)記對(duì)復(fù)壯前后的菌株進(jìn)行遺傳背景分析,并對(duì)復(fù)壯前后菌株轉(zhuǎn)錄組的特異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和功能分析,以期探索原生質(zhì)體再生技術(shù)復(fù)壯金針菇退化菌株的分子機(jī)理,為金針菇菌種退化與提純復(fù)壯的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

試驗(yàn)于2019 年5 月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所進(jìn)行,供試金針菇菌株為H25 及退化的H25-d 菌株,由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。 退化菌株H25-d 為H25 菌株在PDA 培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)20 代時(shí)產(chǎn)生的退化菌株,其外觀表征為菌落不規(guī)則、菌絲稀疏且生長(zhǎng)速率慢,無(wú)法正常栽培出菇。

試劑:溶壁酶購(gòu)于廣東省科學(xué)院微生物研究所;甘露醇購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;蔗糖、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基,搖瓶采用PDB 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基均為美國(guó)BD 公司生產(chǎn)。 木屑培養(yǎng)基:78%木屑,20%麩皮,2%碳酸鈣,含水量為60%。 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基:3.9%PDA 培養(yǎng)基,2%蔗糖。 工廠化液體培養(yǎng)基:2%白砂糖、0.4%豆粕粉、0.05%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀。 工廠化瓶栽培養(yǎng)基:59%木屑、25%玉米芯、15%米糠、1%碳酸鈣,含水量為60%。

1.3 原生質(zhì)體再生菌株的制備

金針菇退化菌株H25-d 的菌絲原生質(zhì)體提取參照前人研究方法進(jìn)行[ 12,17-18]。

在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上有星芒狀菌落出現(xiàn)時(shí),按出現(xiàn)時(shí)間先后依次挑取單菌落進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。 對(duì)再生菌株進(jìn)行鏡檢時(shí),篩選不具有鎖狀聯(lián)合的原生質(zhì)體單核體菌株,將單核體菌株進(jìn)行交配型鑒定并兩兩雜交獲取雜交雙核菌株。

1.4 菌絲生長(zhǎng)測(cè)試

PDA 培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)測(cè)定:使用5 mm 直徑打孔器取接種塊,接種于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中央,25 ℃暗培養(yǎng),當(dāng)菌絲從接種塊上生長(zhǎng)到PDA 平板培養(yǎng)基時(shí),在菌絲前端劃線,在菌絲即將長(zhǎng)滿平板時(shí)再次在菌絲前端劃線,兩次劃線間的直線距離與培養(yǎng)天數(shù)的比值為菌絲生長(zhǎng)速率,每個(gè)平板測(cè)定4 個(gè)方向的生長(zhǎng)速率,取平均值,每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

木屑培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)測(cè)定:將直徑為5 mm 的PDA 菌種塊接種至裝有木屑培養(yǎng)基的200 mm×30 mm玻璃大試管中(每管培養(yǎng)基干質(zhì)量35 g),25 ℃暗培養(yǎng),待菌絲長(zhǎng)到料面2 cm 以下時(shí)沿菌絲前端劃線,培養(yǎng)14 d 后再次在菌絲前端劃線。 測(cè)量?jī)纱蝿澗€之間的長(zhǎng)度,計(jì)算菌絲的平均生長(zhǎng)速率,每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)測(cè)定:利用5 mm 打孔器分別從PDA 培養(yǎng)基上挑取5 個(gè)菌種塊,接種到裝有600 mL液體培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中,在黑暗條件下22 ℃、120 r∕min 振蕩培養(yǎng)。 7 d 后檢測(cè)培養(yǎng)液的pH 和菌絲生長(zhǎng)量(體積測(cè)量法:取10 mL 培養(yǎng)液放入有刻度的離心管中,5 000 r∕min 離心5 min,倒出上清液并測(cè)定體積,培養(yǎng)液與上清液的體積差值占培養(yǎng)液體積的比值為菌絲的體積含量,每個(gè)樣品測(cè)定6 次,取平均值),每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 工廠化栽培測(cè)試

栽培測(cè)試在上海福茂食用菌有限公司進(jìn)行,將培養(yǎng)好的液體菌種接種于1 400 mL 栽培瓶中(每瓶培養(yǎng)料濕質(zhì)量為1 000 g,在121 ℃高壓條件下滅菌2 h,冷卻后接種)。 測(cè)定的農(nóng)藝性狀指標(biāo)包括生育期、原基形成時(shí)間、菇蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌柄數(shù)量以及單瓶產(chǎn)量,所有指標(biāo)測(cè)定均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 樣品總RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

供試退化菌株H25-d 及其復(fù)壯菌株樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行總RNA 提取、轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。 具體參考Trapnell 等[ 19-20]的方法。 采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit 方法構(gòu)建文庫(kù),使用Illumina Hiseq 2000 平臺(tái)測(cè)序。 測(cè)序得到原始序列,使用軟件SeqPrep(https:∕∕github.com∕jstjohn∕SeqPrep)和sickle(https:∕∕github.com∕najoshi∕sickle)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制,得到高質(zhì)量的清潔序列。

1.7 表型數(shù)據(jù)分析及轉(zhuǎn)錄組SNP 分析

利用SPSS 19.0 軟件對(duì)金針菇表型生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。 使用Trinity 軟件(https:∕∕github.com∕trinityrnaseq∕trinityrnaseq∕wiki∕)對(duì)所有測(cè)序的清潔序列進(jìn)行從頭組裝,得到轉(zhuǎn)錄組完整序列,并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)錄本及單基因簇的各項(xiàng)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 以組裝好的轉(zhuǎn)錄組為模板序列,分別將供試菌株H25-d 及其復(fù)壯菌株的原始序列與其進(jìn)行比對(duì),利用SAMtools(https:∕∕samtools.sourceforge.net∕)和VarScan v2.2.7(https:∕∕varscan.sourceforge.net∕)軟件挖掘SNP 位點(diǎn)。

1.8 特異表達(dá)基因的篩選及功能分析

篩選的特異表達(dá)基因?yàn)閮H在退化或復(fù)壯菌株中表達(dá)且轉(zhuǎn)錄本數(shù)量大于600 的基因。 基因功能分析采用NCBI 網(wǎng)站的blastx 搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中相似功能基因,選取匹配度最高項(xiàng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體再生菌株篩選

當(dāng)原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上有星芒狀菌落出現(xiàn)時(shí),按時(shí)間先后依次挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng),在新挑選的菌落中鏡檢出30 個(gè)無(wú)鎖狀聯(lián)合的、生長(zhǎng)性狀較為優(yōu)良的單核體菌株。 對(duì)原生質(zhì)體單核體菌株進(jìn)行交配型鑒定后,采用單單雜交的方式獲取5 個(gè)具有鎖狀聯(lián)合的雜交雙核菌株。 獲得的再生雙核體菌株為原生質(zhì)體再生菌株,稱為H25-dD。 在PDA 培養(yǎng)基上的H25-dD 菌落外觀與正常菌株H25 相似,長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于退化菌株H25-d(圖1)。

圖1 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the tested strains on PDA medium

2.2 菌絲生長(zhǎng)性狀的觀察

為進(jìn)一步檢測(cè)原生質(zhì)體再生技術(shù)對(duì)H25-d 菌株的復(fù)壯效果,觀察相同培養(yǎng)條件下H25 和H25-dD 菌株在PDA 培養(yǎng)基、木屑培養(yǎng)基、液體菌種培養(yǎng)基中的菌絲生長(zhǎng)情況。 H25 與H25-dD 菌株在PDA 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率分別為(4.63 ±0.15)mm∕d 和(4.68 ±0.14)mm∕d;在木屑培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率分別為(3.51 ±0.07)mm∕d 和(3.53 ±0.08) mm∕d;搖瓶培養(yǎng)7 d 后的培養(yǎng)液pH 分別為(6.28 ±0.01)和(6.30 ±0.07),菌絲量分別為(21.13 ±0.21)%和(21.76 ±0.92)%。 以上4 個(gè)指標(biāo)之間的差異均未達(dá)顯著水平,表明H25-dD 的菌絲生長(zhǎng)性狀恢復(fù)到原有正常菌株水平。

2.3 菌株栽培農(nóng)藝性狀的觀察

菌株成熟后的子實(shí)體農(nóng)藝性狀是非常重要的指標(biāo),特別是產(chǎn)量。 試驗(yàn)進(jìn)一步觀察了H25 與H25-dD菌株在工廠化條件下的出菇情況。 從表1 可以看出,H25 和H25-dD 菌株的菌絲生育期、原基形成時(shí)間均完全一致,分別為23 d 和5 d;菌蓋直徑平均值分別為5.32 mm 和5.29 mm;菌柄長(zhǎng)度平均值分別為134.27 mm和132.54 mm;單瓶子實(shí)體平均數(shù)量分別為1 228.65 個(gè)和1 315.84 個(gè);單瓶平均產(chǎn)量分別為478.67 g 和476.30 g。 以上6 個(gè)指標(biāo)之間均沒(méi)有顯著差異,表明H25-dD 菌株可以恢復(fù)到與H25 菌株相當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝性狀。 如圖2 所示,H25-dD 菌株的子實(shí)體形態(tài)與H25 菌株無(wú)明顯差異,復(fù)壯效果理想。

表1 供試菌株在工廠化培養(yǎng)條件下的農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of the tested strains under factory culture conditions

圖2 供試菌株的子實(shí)體形態(tài)Fig.2 Fruiting body morphology of the tested strains

2.4 轉(zhuǎn)錄組序列的組裝及SNP 分析

為了進(jìn)一步探索原生質(zhì)體再生技術(shù)復(fù)壯金針菇退化菌株的內(nèi)在機(jī)理,本研究基于轉(zhuǎn)錄組挖掘的SNP位點(diǎn)對(duì)比了H25-d 及H25-dD 菌株的遺傳背景差異。 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)組裝共得到27 736 個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Transcript)以及18 064 個(gè)單基因簇(Unigene)。 轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度為1 444.65 bp,單基因簇的平均長(zhǎng)度為1 227.17 bp。

以組裝好的轉(zhuǎn)錄組序列為模板,將H25-d 及H25-dD 菌株的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),挖掘SNP 位點(diǎn)。 結(jié)果顯示,H25-d 菌株與模板比對(duì)共產(chǎn)生12 423 個(gè)SNP 位點(diǎn),平均每kb 出現(xiàn)的頻率為0.31 個(gè)。 SNP 在轉(zhuǎn)錄組單基因簇中的位置分布表明,有4 041 個(gè)位于基因的第一密碼子區(qū)域,有3 950 個(gè)位于第二密碼子區(qū)域,有4 115 個(gè)位于第三密碼子區(qū)域,在3’和5’端非編碼區(qū)均未發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn),有317 個(gè)SNP 沒(méi)有明確的分布區(qū)域。 H25-dD 菌株與模板比對(duì)共產(chǎn)生13 093 個(gè)SNP 位點(diǎn),平均每kb 出現(xiàn)的頻率為0.32 個(gè)。 SNP 在單基因簇中的位置分布表明,有4 240 個(gè)位于第一密碼子區(qū)域,有4 045 個(gè)位于第二密碼子區(qū)域,有4 324個(gè)位于第三密碼子區(qū)域,在3’和5’端非編碼區(qū)均未發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn),有484 個(gè)SNP 沒(méi)有明確的分布區(qū)域。

分析SNP 的堿基序列發(fā)現(xiàn),其包含置換和顛換兩種類型的多態(tài)性位點(diǎn)。 H25-d 的SNP 中發(fā)生置換的堿基類型為C∕T 和A∕G,數(shù)量分別為4 558 個(gè)和4 768 個(gè),轉(zhuǎn)錄組每kb 出現(xiàn)的頻率均為0.11 個(gè)。 發(fā)生顛換的堿基有4 種類型,分別為A∕T、A∕C、T∕G 和C∕G,對(duì)應(yīng)的數(shù)量分別為979 個(gè)、689 個(gè)、856 個(gè)和573 個(gè),在轉(zhuǎn)錄組上每kb 出現(xiàn)的頻率分別為0.02 個(gè)、0.01 個(gè)、0.02 個(gè)和0.01 個(gè)。 H25-dD 菌株的SNP 中發(fā)生置換的堿基類型為C∕T 和A∕G,數(shù)量分別為4 765 個(gè)和4 975 個(gè),轉(zhuǎn)錄組每kb 出現(xiàn)的頻率分別為0.11 個(gè)和0.12 個(gè)。 發(fā)生顛換的堿基類型分別為A∕T、A∕C、T∕G 和C∕G,對(duì)應(yīng)的數(shù)量分別為1 029 個(gè)、768 個(gè)、850 個(gè)和706 個(gè),在轉(zhuǎn)錄組上每kb 出現(xiàn)的頻率分別為0.02 個(gè)、0.01 個(gè)、0.02 個(gè)和0.01 個(gè)。

H25-d 與H25-dD 菌株的SNP 分布情況比較表明,兩個(gè)菌株在SNP 數(shù)量及位置分布上均存在差異。在SNP 數(shù)量方面,H25-dD 菌株比H25-d 菌株多670 個(gè),其中有199 個(gè)位于基因的第一密碼子區(qū)域,有95個(gè)位于第二密碼子區(qū)域,有209 個(gè)位于第三密碼子區(qū)域,有167 個(gè)沒(méi)有明確的分布位置。 在SNP 堿基類型方面兩類菌株也有較大差異,H25-dD 菌株比H25-d 菌株發(fā)生C∕T 型堿基轉(zhuǎn)換的數(shù)量多207 個(gè)、A∕G 型多207 個(gè)。 H25-dD 菌株比H25-d 菌株發(fā)生顛換的A∕T 類型多50 個(gè)、A∕C 類型多79 個(gè)、T∕G 類型少5 個(gè)、C∕G 類型多133 個(gè)。 上述差異SNP 位點(diǎn)表明,原生質(zhì)體再生后菌株的遺傳背景產(chǎn)生了變化,且這些變化多位于基因的密碼子區(qū)域。

2.5 特異表達(dá)基因分析

基于SNP 位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果,進(jìn)一步對(duì)H25-d 及H25-dD 菌株中特異表達(dá)基因進(jìn)行挖掘,篩選出僅在各自轉(zhuǎn)錄組特異表達(dá)的基因。 結(jié)果表明,復(fù)壯菌株的特異表達(dá)基因數(shù)量遠(yuǎn)高于退化菌株。 如表2 所示,H25-d 菌株轉(zhuǎn)錄本數(shù)量大于600 的特異表達(dá)基因僅有c1661_g1,且未匹配到已知功能的相似基因。H25-dD 菌株中轉(zhuǎn)錄本數(shù)量大于600 的特異表達(dá)基因數(shù)量有15 個(gè)。 功能分析表明,H25-dD 菌株的基因表達(dá)在細(xì)胞能量代謝、抗氧化、細(xì)胞骨架構(gòu)建以及細(xì)胞DNA 甲基化修飾等方面發(fā)生了較大變化。 其中基因c8593_g1、c12033_g1 與細(xì)胞內(nèi)ATP 的合成有關(guān)[ 21];c10839_g1、c4223_g1、c10584_g3、c11072_g1、c11025_g3 分別為細(xì)胞色素C 氧化酶、NADH 脫氫酶、細(xì)胞色素b-c1 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)單元,參與細(xì)胞能量代謝中重要的氧化磷酸化代謝途徑[ 22-25]。 c12025_g1 為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶相關(guān)基因,參與細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)代謝途徑[ 26]。 c11989_g2 為烯醇化酶相關(guān)基因,烯醇化酶是催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸的酶,是糖酵解的關(guān)鍵酶之一[ 27]。 c12016_g1 為熱激蛋白家族相關(guān)基因,編碼70 ku 熱激蛋白,該蛋白是細(xì)胞內(nèi)抵抗氧化脅迫和參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要物質(zhì)[ 28]。 c11822_g3 為谷氨酰胺合成酶相關(guān)基因,與細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物谷胱甘肽的合成有關(guān)[ 29]。 c12031_g1 為微管蛋白相關(guān)基因,主要參與細(xì)胞骨架構(gòu)建及細(xì)胞分裂等生物學(xué)過(guò)程[ 30]。 c11997_g2 為半胱氨酸蛋白酶相關(guān)基因,半胱氨酸蛋白酶一般存在于細(xì)胞的溶酶體中,主要參與細(xì)胞吞噬和細(xì)胞內(nèi)多余物質(zhì)的清除和消化[ 31]。 c11938_g1 為S-腺苷甲硫氨酸合成酶相關(guān)基因,是催化腺苷三磷酸(ATP)和甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸的酶,而S-腺苷甲硫氨酸是細(xì)胞DNA 甲基化的主要供體[ 32]。 c12006_g1 為半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因,同樣參與細(xì)胞的DNA 甲基化修飾作用[ 33]。

3 結(jié)論與討論

工廠化栽培的白色金針菇優(yōu)良品種在使用一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)大量粉孢子產(chǎn)生、菌絲生長(zhǎng)不一致、出菇不齊、產(chǎn)量下降等退化現(xiàn)象。 菌種退化會(huì)給金針菇生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)較大損失,如何有效緩解菌種退化是金針菇產(chǎn)業(yè)需要研究的重要問(wèn)題。

金針菇菌種的提純復(fù)壯是緩解菌種退化的有效方法之一,常用方法主要有增加菌絲營(yíng)養(yǎng)、尖端菌絲分離、組織分離及原生質(zhì)體制備等。 陳志松[ 34]研究認(rèn)為,挑取菌褶處的組織塊進(jìn)行分離可有效復(fù)壯退化的金針菇菌種。 李雪飛等[ 35]采用組織分離和菌絲尖端分離的方法,結(jié)合構(gòu)樹基質(zhì)培養(yǎng)和藍(lán)光處理對(duì)退化金針菇菌絲進(jìn)行了復(fù)壯。 劉昆昂等[ 36]利用結(jié)晶紫PDA 培養(yǎng)基結(jié)合原生質(zhì)體制備技術(shù)對(duì)黃色金針菇退化菌株進(jìn)行了復(fù)壯。 本研究制備的原生質(zhì)體單核體雜交菌株可有效恢復(fù)白色金針菇退化菌株的農(nóng)藝性狀,與前人的研究結(jié)果較為一致。 本研究獲得的原生質(zhì)體再生菌株的產(chǎn)量等指標(biāo)并沒(méi)有顯著超過(guò)對(duì)照菌株,其原因是對(duì)照菌株為液氮保藏的原始母種,尚未經(jīng)歷長(zhǎng)期的繼代培養(yǎng),其菌株性狀優(yōu)良,復(fù)壯后的菌株在同樣培養(yǎng)條件下較難超越原始母種。 若想利用原生質(zhì)體再生技術(shù)獲得產(chǎn)量等指標(biāo)上超過(guò)原菌株的菌株,可在原生質(zhì)體再生過(guò)程中進(jìn)行誘變育種,篩選出產(chǎn)量等指標(biāo)超越原始母種的優(yōu)良變異菌株。 另外,也可嘗試采用加富培養(yǎng)基對(duì)獲得的原生質(zhì)體再生菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的SNP 標(biāo)記對(duì)復(fù)壯前后菌株的遺傳背景分析顯示,原生質(zhì)體再生菌株的遺傳背景發(fā)生了變化,復(fù)壯后菌株的SNP 位點(diǎn)比退化菌株的SNP 位點(diǎn)多670 個(gè),這些位點(diǎn)大部分位于基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的密碼子區(qū)域,說(shuō)明原生質(zhì)體再生對(duì)菌株的遺傳背景產(chǎn)生了影響,與表型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生了變化。 本研究進(jìn)一步篩選了退化和復(fù)壯菌株中轉(zhuǎn)錄本數(shù)量超過(guò)600 的特異表達(dá)基因,通過(guò)基因功能分析明確了細(xì)胞能量代謝、抗氧化、細(xì)胞骨架構(gòu)建以及細(xì)胞DNA 甲基化修飾等方面相關(guān)的基因在復(fù)壯菌株中特異表達(dá),這些基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的正常代謝和清除有害物質(zhì)具有重要作用,這與Wang 等[ 28]在金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)中的研究結(jié)果較為一致。

基于上述分析,初步認(rèn)為原生質(zhì)體再生技術(shù)能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力及對(duì)有毒有害物質(zhì)的清除能力,打破有害物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、ATP 合成以及DNA 甲基化修飾、骨架構(gòu)建等重要代謝途徑功能紊亂的惡性循環(huán),使細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育重回正軌,從而達(dá)到菌株復(fù)壯的效果。