張舒雅, 孫洪英, 毛 戩, 孟晨曦, 巴格隆

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院老年病科，內(nèi)蒙古 包頭 014030；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院功能科，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，全世界約有7 000 萬人受該疾病的影響，患病人群主要集中在中低收入國家［1］。癲癇被認(rèn)為是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元失衡引起的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常超同步放電，其典型臨床特征是反復(fù)發(fā)作性的癇樣發(fā)作和廣泛或局部的肌肉痙攣和抽搐［2-3］。癲癇的致死率和致殘率嚴(yán)重影響癲癇患者及其家庭，也給社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者對癲癇的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探索。環(huán)狀RNA （circular RNA，circRNA）是非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA）重要的組成部分，其結(jié)構(gòu)上無信使RNA 的5′（cap）和3′ poly（A）結(jié)構(gòu)，其通過外顯子、內(nèi)含子或2 個外顯子-內(nèi)含子的反向剪接和融合形成共價鍵后連接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過充當(dāng)微小RNA （microRNA，miRNA）分子海綿來調(diào)控基因表達(dá)［4-9］。近年來，部分circRNA 被強調(diào)為人類疾病的關(guān)鍵參與者，包括癲癇等疾病［10］。GONG 等［11］發(fā)現(xiàn)：在癲癇患者中，circ_0067835 mRNA 表達(dá)水平明顯降低，過表達(dá)circ_0067835 可通過充當(dāng)miR-155 分子海綿調(diào)控叉頭框蛋白O3a（forkheacd box O3a，F(xiàn)OXO3a）基因的表達(dá)，從而抑制SH-SY5Y 細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞凋亡。ZHENG 等［12］發(fā)現(xiàn)：circ_DROSHA 過表達(dá)可通過靶向miR-106b-5p 調(diào)控心肌細(xì)胞增強因子2C（myocyte enhancer 2C，MEF2C），減輕無鎂溶液誘導(dǎo)的TLE 細(xì)胞模型損傷。LIN 等［13］發(fā)現(xiàn)：circ_ANKMY2 通過miR-106b-5p/叉頭框蛋白P1（frokhead box P1，F(xiàn)OXP1）軸調(diào)控顳葉癲癇的進(jìn)展。CHEN 等［14］發(fā)現(xiàn)：circ_0003170 通過調(diào)節(jié)miR-421/CCL2 軸在癲癇細(xì)胞模型中加重人海馬神經(jīng)元損傷。研究［10］證實：在癲癇患者腦組織中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高，提示其具備成為診斷癲癇生物標(biāo)志物和治療靶點的潛在可能性。然而，circ_EFCAB2 在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確。本研究探討circ_EFCAB2 在體外癲癇細(xì)胞模型中的差異表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析，闡明其可能的作用機(jī)制，為circ_EFCAB2 參與癲癇發(fā)病機(jī)制中作用的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人神經(jīng)母細(xì)胞瘤LAN-5 細(xì)胞（上海百曄生物科技有限公司）。TRIzol試劑（美國 Sigma 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）試劑盒（美國 ABI 公司），核質(zhì)分離試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）R 核酸外切酶（美國賽默飛公司），CCK-8 檢測試劑盒（上海初態(tài)生物科技有限公司），RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基和DMEM 培養(yǎng)基（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。酶聯(lián)免疫檢測儀（美國 Bio-Rad 公司），全自動PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司），流式細(xì)胞儀和培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司），－80 ℃超低溫冰箱（日本三洋公司），電子恒溫水浴箱（上海新苗醫(yī)療器械制造公司），微量移液器（德國艾本德科技公司）。

1.2 癲癇細(xì)胞模型制備和分組LA-N-5 細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞系保存在必需培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含10%胎牛血清、10%青-鏈霉素。實驗分為對照組和模型組。對照組為LA-N-5 細(xì)胞中加入正常細(xì)胞外液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 h，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。模型組即無鎂致癇組：建立體外顳葉癲癇細(xì)胞模型，將LA-N-5 細(xì)胞在無鎂細(xì)胞外液（145 mmol·L－1NaCl、2.5 mmol·L－1KCl、2 mmol·L－1氯化鈣、10 mmol·L－1葡萄糖、10 mmol·L－14-羥乙基哌嗪乙磺酸和0.001 mmol·L－1甘氨酸，pH 7.4）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用電流鉗記錄癲癇細(xì)胞模型自發(fā)高頻率，癇樣放電頻率高于3 Hz 表明癲癇細(xì)胞模型建立成功。

1.3 RT-qPCR 法檢測2 組細(xì)胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平采用 TRIzoI 法提取細(xì)胞中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置PCR 反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件，其中反應(yīng)體系為10 μL，以GAPDH 為內(nèi)參，所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃、10 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 個循環(huán)。每組設(shè)置5 個復(fù)孔，采用2－△△Ct法計算細(xì)胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平。實驗重復(fù) 3 次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 RNA 酶消化實驗和RT-qPCR 法檢測細(xì)胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平癲癇細(xì)胞模型提取總RNA，52 μL DEPC 水重懸。將細(xì)胞分為2 組，一組進(jìn)行RNase R 消化（RNase R 消化組），另一組作為對照（RNase R 未消化組）。RNase R 消化組加入3 μL 10×RNase R Reaction Buffer，0.1 μL 20 U·μL－1RNase R，未消化組加入3 μ L 10× RNase R Reaction Buffer，0.1 μL DEPC 水，37 ℃、1 h。采用RT-qPCR 法檢測2 組細(xì)胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平。以GAPDH 為內(nèi)參，采用 2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達(dá)水平，實驗重復(fù)3 次。

1.5 核質(zhì)分離實驗檢測癲癇細(xì)胞中circ-EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平癲癇模型細(xì)胞，按照核質(zhì)分離試劑盒說明書操作。分離的RNA 采用RT- qPCR法檢測細(xì)胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平。在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中分別以GAPDH 和U6 作為內(nèi)參，采用 2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達(dá)水平，實驗重復(fù)3 次。

1.6 CCK-8 法檢測2 組細(xì)胞增殖能力于96 孔細(xì)胞板中接種細(xì)胞懸液，每孔100 μL，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h 細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。酶標(biāo)儀測定波長450 nm 處吸光度（A）值，以A 值代表細(xì)胞增殖能力。每組設(shè)置 5 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組細(xì)胞凋亡率待測細(xì)胞消化離心，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞1 次，胰酶消化，重新懸浮于PBS 緩沖液中，預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，加入 Annexin Ⅴ-APC 和 PI 染料，避光染色20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，采用FlowJo 軟件分析流式細(xì)胞術(shù)測得的原始數(shù)據(jù)。細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實驗重復(fù)3 次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率待細(xì)胞生長至覆蓋率約為 80%時取待測細(xì)胞，消化離心，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞1 次，胰酶消化，重新懸浮于PBS 緩沖液中，4 ℃下將細(xì)胞固定在70%乙醇中過夜，加入PI 染料，避光染色30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測，實驗重復(fù)3 次。記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光，采用DNA MultiCycle 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0 和 GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞中circ_EFCAB2 mRNA 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡率及不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率均符合正態(tài)分布，以±s 表示，組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癲癇細(xì)胞模型鑒定全細(xì)胞電流鉗記錄方式下顯示：模型組細(xì)胞有自發(fā)高頻率的癇樣放電，頻率高于3 Hz，對照組細(xì)胞僅有少量的偶發(fā)動作電位，提示癲癇細(xì)胞模型建立成功。

2.2 2 組細(xì)胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平與對照組（0.99±0.02）比較，模型組細(xì)胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平（1.34±0.03）升高（P＜0.05）。

2.3 RNA 酶處理后2 組細(xì)胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平與RNase R 未消化組比較，RNase R 消化組細(xì)胞中線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 2 組細(xì)胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of circ_EFCAB2 and linear EFCAB2 mRNA in cells in two groups (n=3,±s)

表2 2 組細(xì)胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of circ_EFCAB2 and linear EFCAB2 mRNA in cells in two groups (n=3,±s)

Group RNaseR undigestion RNaseR digestion tP Circ_EFCAB2 mRNA 1.002 7±0.091 9 1.329 3±0.498 0－0.97 0.434 Linear EFCAB2 mRNA 1.000 3±0.039 5 0.001 3±0.000 6 44.32 0.001

2.4 癲癇模型細(xì)胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平癲癇細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平為（47.13%±2.76%），在細(xì)胞核中表達(dá)水平為（52.87%±2.76%），組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 2 組細(xì)胞增殖能力CCK-8 法檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染72 h 時，與對照組比較，模型組細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 CCK-8 法檢測2 組細(xì)胞增殖能力Fig.1 Proliferation activities of cells in two groups detected by CCK-8 method

2.6 2 組細(xì)胞凋亡率與對照組（4.78%±0.64%）比較，模型組細(xì)胞凋亡率（21.11%±0.72%）明 顯 升 高 （P＜0.01）。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of cells in two groups detected by flow cytometry

2.7 2 組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率對照組S 期細(xì)胞百分率為（50.11%±3.44%），G1+G2期細(xì)胞百分率為（49.89%±3.44%）。與對照組比較，模型組S 期細(xì)胞百分率（23.20%±1.03%）明顯降低（P＜0.01），G1+G2期細(xì)胞百分率（76.80%±1.03%）明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 2 組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率Fig.3 Percentages of cells at different cell cycles in two groups

3 討 論

circRNA 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富且較為穩(wěn)定［15-16］。circRNA 是由多種神經(jīng)元特異性基因產(chǎn)生的，其可能參與大腦發(fā)育和突觸可塑性，circRNA表達(dá)異?？赡芘c神經(jīng)退行性疾病和急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的繼發(fā)性腦損傷有關(guān)。因此，識別circRNA 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的表達(dá)改變和功能作用，可能提供新的診斷工具和治療靶點。研究［10］顯示：采用高通量測序法檢測癲癇患者，發(fā)現(xiàn)442 個circRNA 異常表達(dá)，在癲癇患者腦組織中circ_EFCAB2 表達(dá)水平較正常人明顯上調(diào)。結(jié)合本課題組前期研究［17］證實：癲癇患者血清中circ_EFCAB2 表達(dá)水平明顯升高，提示circ_EFCAB2 與癲癇的發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性。circ_EFCAB2 可能是通過調(diào)節(jié)miRNA 海綿分子circRNA-miRNA 基因軸來調(diào)控癲癇的發(fā)生發(fā)展，且circ_EFCAB2 通過與miR-485P 相互作用增加氯通道6 的表達(dá)水平，其與電興奮性和離子穩(wěn)態(tài)等多種生理過程有關(guān)［10］。

綜上所述，癲癇患者血清和癲癇細(xì)胞模型中circ_EFCAB2 mRNA 表達(dá)水平升高，circ_EFCAB2可能通過觸發(fā)神經(jīng)元損傷，包括細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等方式促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。這可能為癲癇提供了一種新的診斷標(biāo)志位和治療靶點。