黃 波, 丁 潔, 郭紅榮, 王紅娟, 徐建群, 鄭 泉

（1.湖北省武漢市第三醫(yī)院 武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430070；2.湖北省武漢市第三醫(yī)院 武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院血液透析室，湖北 武漢 430070）

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率約占全部肺癌發(fā)病率的85%。肺癌具有較高的死亡率和發(fā)病率，因此其早期診斷十分重要［1-2］。隨著人們生活方式的改變和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肺癌的發(fā)病率逐年升高，給人類健康造成極大威脅［3］。以順鉑為基礎(chǔ)的化療是目前治療肺癌的主要方法，但化療藥物缺乏特異性且具有明顯不良反應(yīng)，因此尋找新的靶點(diǎn)對(duì)肺癌診斷和治療具有重要意義［4］。

研究［5］表明：缺氧誘導(dǎo)因子1α （hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在肺癌患者血清中的表達(dá)明顯上調(diào)。常氧條件下，HIF-1α 表達(dá)的蛋白會(huì)被迅速降解，而缺氧條件下降解途徑被破壞，腫瘤細(xì)胞中的HIF-1α 通過(guò)調(diào)控糖酵解途徑相關(guān)酶的表達(dá)促進(jìn)葡萄糖代謝為乳酸，使HIF-1α 能夠在缺氧環(huán)境中生存［6］。自噬在人類腫瘤等疾病的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。缺氧條件下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和HIF-1α 均可誘導(dǎo)自噬，并影響腫瘤的進(jìn)展［8-9］，但在肺癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究以A549 細(xì)胞作為研究對(duì)象，構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型，探討HIF-1α 和ROS 的相互作用及其對(duì)A549 缺氧細(xì)胞模型自噬及生物學(xué)行為的影響，為肺癌的靶點(diǎn)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)。HIF-1α 抑制劑利非西呱（lificiguat，YC-1）和ROS 抑制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F(xiàn)12K 和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司，CCK-8 試劑、抗熒光衰減封片劑、結(jié)晶紫和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，TRIzol 試劑購(gòu)于美國(guó)Ambion 公司，SYBR FAST qPCR Master Mix 購(gòu)于美國(guó)KAPA Biosystems 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa 公司，ROS 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，熒光集團(tuán)488 標(biāo)記的羊抗兔抗體、微管相關(guān)蛋白輕鏈 3 Ⅱ（microtubuleassociated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、HIF-1α 和人甲酰肽受體1 （formy peptide receptor，F(xiàn)PR1）抗體購(gòu)于武漢貝茵萊生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒和Matrigel 購(gòu)于美國(guó)BD 公司，PVDF 轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱（311）和直熱式CO2三氣培養(yǎng)箱（FormaTM8000）購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司，倒置熒光顯微鏡（DMIL LED）和切片機(jī)（S6E）購(gòu)于德國(guó)Leica 公司，PCR 儀（GE48527）購(gòu)于杭州柏恒科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（CFX-Connect 96）和電泳儀（mini protean 3 cell）購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司，超微量分光光度計(jì)（Nano-300）購(gòu)于杭州奧盛儀器有限公司，流式細(xì)胞儀（NovoCyte）購(gòu)于杭州艾森生物有限公司，透射電鏡（HT7700）購(gòu)于日本日立公司，酶標(biāo)儀（MK3）購(gòu)于芬蘭雷勃公司，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（Tanon-5200）購(gòu)于上海天能科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧細(xì)胞模型構(gòu)建采用含10%胎牛血清的F-12K 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)A549 細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，按1∶2 比例進(jìn)行傳代。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞周期同步化，將細(xì)胞置于含94% N2、1% O2和5% CO2混合氣體的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 和72 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)［10］。

1.3 模型鑒定以常氧培養(yǎng)（21% O2）的A549細(xì)胞作為對(duì)照，RT-qPCR 法檢測(cè)不同處理時(shí)間細(xì)胞中HIF-1α mRNA 表達(dá)水平，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA，RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α mRNA 表達(dá)水平。引物序列：HIF-1α F 5′-GAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，HIF-1α R 5′-TCACAAATCAGCACCAAGC-3′；GAPDH F 5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，GAPDH R 5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算HIF-1α mRNA 表達(dá)水平。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處各孔吸光度（A）值，以A值代表細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。缺氧條件下細(xì)胞增殖能力較好，HIF-1α 高表達(dá)表明缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞模型構(gòu)建成功，并由此確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.4 細(xì)胞分組和處理將A549 細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、NAC 組、NAC+YC-1 組和YC-1 組。對(duì)照組細(xì)胞在常氧（21% O2）條件下培養(yǎng)，其余4 組細(xì)胞均按照“1.3”步驟中方法誘導(dǎo)24 h；模型組只進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)，不做其他處理；NAC 組缺氧誘導(dǎo)后采用20 mmol·L－1NAC 誘導(dǎo)24 h［8］；NAC+YC-1 組缺氧誘導(dǎo)后采用20 mmol·L－1NAC 和100 μmol·L－1YC-1 誘導(dǎo)24 h［11］；YC-1 組缺氧誘導(dǎo)后采用100 μmol·L－1YC-1 誘導(dǎo)24 h。干預(yù)完成后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表達(dá)水平。引物序列：HIF-1α 上游引物，5′-TGCTTGGTGCTGATTTGTG-3′，HIF-1α 下游引物，5′-TGTCCTGTGGTGACTTGTCC-3′；FPR1 上游引物，5′-GTCGCAGCAGCCTTTTTT-3′，F(xiàn)PR1 下游引物，5′-CCAGGGCACTTGTCACATC-3′；GAPDH 上游引物，5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表達(dá)水平。同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量，Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 蛋白表達(dá)水平，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS 水平采用無(wú)血清培養(yǎng)液按照1∶1 000 的比例稀釋DCFHDA，使終濃度為10 μmol·L－1。采用1 mL 稀釋的DCFH-DA 重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×106mL－1，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，使探針和細(xì)胞充分接觸。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3 次，收集細(xì)胞并用500 μL PBS 緩沖液重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度表示各組細(xì)胞中ROS 水平。

1.7 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬體結(jié)構(gòu)取1×107個(gè)細(xì)胞，采用2.5%戊二醛4 ℃預(yù)固定30 min 以上，PBS 緩沖液洗滌3 次，1% 鋨酸后固定1 h，PBS 緩沖液洗滌3 次后進(jìn)行梯度脫水，丙酮和環(huán)氧樹(shù)脂812 按照1∶1 的比例40 ℃半浸透6 h，純環(huán)氧樹(shù)脂40 ℃全浸透4 h，包埋板包埋，加入包埋劑，置于聚合包埋箱聚合，采用切片機(jī)進(jìn)行超薄切片。醋酸鈾避光染色20 min，雙蒸水洗滌3 次，枸櫞酸鉛避光染色15 min，洗去多余鉛液，吸干后透射電鏡觀察并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)情況

收集各組細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入1 mL 0.5%Triton X-100 室溫通透30 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入1 mL 5%BSA 37 ℃封閉1 h，棄封閉液，加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液洗滌后加入二抗稀釋液，37 ℃孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌后加入含DAPI 的抗熒光淬滅封片液，置于熒光顯微鏡下拍照并記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率收集各組細(xì)胞，取1×106個(gè)培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，400 g、4 ℃離心5 min，棄上清，加入1 mL 預(yù)冷的PBS 緩沖液，混勻后棄上清，200 μL PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL PI，混勻后4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 緩沖液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（右上象限凋亡細(xì)胞數(shù)+右下象限凋亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.10 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組侵襲細(xì)胞數(shù)

收集各組細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1×105mL－1，稀釋基質(zhì)膠并鋪在Transwell 小室中，干燥后取200 μL 細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室中，下層24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入0.75 mL含10% 胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 緩沖液洗滌，加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液，染色30 min，取出小室，用棉簽擦去上層細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，采用Image J 軟件計(jì)算各組侵襲細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同處理時(shí)間各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表達(dá)水平，各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 蛋白表達(dá)水平，各組細(xì)胞中ROS水平，不同處理時(shí)間各組細(xì)胞增殖能力，各組細(xì)胞凋亡率和侵襲細(xì)胞數(shù)均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧環(huán)境下A549 細(xì)胞HIF-1α mRNA 表達(dá)水平和增殖能力與0 h 比較，低氧誘導(dǎo)12、24、48和72 h 時(shí)，細(xì)胞中HIF-1α mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），隨著A549 細(xì)胞在低氧環(huán)境中的時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α mRNA 表達(dá)水平升高。與對(duì)照組比較，低氧誘導(dǎo)24、48 和72 h 時(shí)，模型組細(xì)胞增殖能力明顯升高（P＜0.01）。結(jié)合兩部分結(jié)果確定低氧誘導(dǎo)時(shí)間為24 h。見(jiàn)圖1 和2。

圖1 缺氧條件下A549 細(xì)胞中HIF-1α mRNA 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of HIF-1α mRNA in A549 cells under hypoxia condition

圖2 缺氧條件下A549 細(xì)胞增殖能力Fig.2 Proliferation activities of A549 cells under hypoxia condition

2.2 各組A549 細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，NAC 組、NAC+YC-1 組和YC-1 組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01），其中NAC+YC-1 組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表達(dá)水平最低。與NAC 組比較，NAC+YC-1 組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3 和4。

圖3 各組細(xì)胞中HIF-1α(A)和FPR1(B) mRNA 表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of HIF-1α（A) and FPR1（B) mRNA in cells in various groups

圖4 各組細(xì)胞中HIF-1α 和FPR1 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B,C）Fig.4 Electrophoregram(A) and histograms(B,C) of expressions of HIF-1α and FPR1 proteins in cells in various groups

2.3 各組A549 細(xì)胞中ROS 水平與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中ROS 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，NAC 組、NAC+YC-1 組和YC-1 組細(xì)胞中ROS 水平均明顯降低（P＜0.01），其中NAC+YC-1 組細(xì)胞中ROS 水平最低。與NAC 組比較，NAC+YC-1 組細(xì)胞中ROS 水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖5 和6。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS 水平Fig.5 ROS levels in cells in various groups detected by flow cytometry

圖6 各組細(xì)胞中ROS 水平Fig.6 ROS levels in cells in various groups

2.4 各組A549 細(xì)胞自噬體超微結(jié)構(gòu)對(duì)照組細(xì)胞中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)自噬體結(jié)構(gòu)；模型組細(xì)胞中可見(jiàn)大量自噬體，可見(jiàn)明顯空泡，細(xì)胞中細(xì)胞器也被降解；與模型組比較，NAC組、NAC+YC-1 組和YC-1 組細(xì)胞中自噬體減少，其中NAC+YC-1 組細(xì)胞中自噬體最少。見(jiàn)圖7。

圖7 透射電鏡觀察各組細(xì)胞中自噬體超微結(jié)構(gòu)（×12 000）Fig.7 Ultrastructures of autophagosomes in cells in various groups observed by transmission electron microscope(×12 000)

2.5 各組A549 細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)情況與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)強(qiáng)度明顯增加。與模型組比較，NAC組、NAC+YC-1組和YC-1組細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)明顯減少，其中NAC+YC-1 組細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)最少。見(jiàn)圖8。

圖8 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)強(qiáng)度(×200)Fig.8 Expression intensities of LC3-Ⅱ in cells in various groups detected by immunofluorescence method(×200)

2.6 各組A549 細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，NAC 組、NAC+YC-1 組和YC-1 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），其中NAC+YC-1 組細(xì)胞凋亡率升高最明顯。與NAC 組比較，NAC+YC-1 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖9 和10。

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.9 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

圖10 各組細(xì)胞凋亡率Fig.10 Apoptotic rates of cells in various groups

2.7 各組A549 侵襲細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，模型組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，NAC 組、NAC+YC-1 組和YC-1 組侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P＜0.01），其中NAC+YC-1組侵襲細(xì)胞數(shù)減少最明顯。與NAC組比較，NAC+YAC-1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見(jiàn)圖11和12。

圖11 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫，×200)Fig.11 Invasion of cells in various groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet,×200)

圖12 各組侵襲細(xì)胞數(shù)Fig.12 Numbers of invasion cells in various groups

3 討 論

缺氧是肺癌患者腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要特征，腫瘤細(xì)胞缺氧時(shí)細(xì)胞代謝會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致脂質(zhì)積累，使腫瘤細(xì)胞免受氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，并能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［12-13］。研究［14］顯示：HIF-1α 表達(dá)是缺氧的標(biāo)志，HIF-1α 在維持缺氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示：A549 細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的時(shí)間越長(zhǎng)，HIF-1α mRNA 表達(dá)水平越高；腫瘤細(xì)胞增殖能力隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，提示缺氧細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

缺氧條件下細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，引起ROS 的過(guò)量合成［15］。本研究結(jié)果顯示：NAC 與YC-1 效果相同，均能明顯降低缺氧細(xì)胞模型中ROS 和HIF-1α 水平，且NAC 和YC-1 聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)降低ROS 和HIF-1α 水平作用更明顯，提示ROS 與HIF-1α 能夠相互作用和影響。研究［16］表明：FPR1 與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，F(xiàn)PR1 表達(dá)水平升高能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和成瘤能力。本研究結(jié)果顯示：NAC 和YC-1 均可下調(diào)FPR1 表達(dá)，表明ROS 和HIF-1α 可能通過(guò)調(diào)節(jié)FPR1 的表達(dá)來(lái)影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。

自噬對(duì)于維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用，已被證實(shí)為包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的治療和干預(yù)靶點(diǎn)［17-19］。研究［8-9，20-21］顯示：缺氧可介導(dǎo)ROS 和HIF-1α 通過(guò)不同的途徑促進(jìn)結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和肺癌等細(xì)胞的自噬，并影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示：NAC 和YC-1 單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用均可改變A549 細(xì)胞中自噬體結(jié)構(gòu)，并減少細(xì)胞器的損傷。微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubuleassociated protein light chain 3，LC3）是最早被發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)志物，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，其中LC3-Ⅱ水平與細(xì)胞中自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，是反映細(xì)胞自噬活性的重要指標(biāo)［22-23］。NAC 和YC-1 處理后細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)明顯下調(diào)，且NAC 和YC-1 聯(lián)合處理后LC3-Ⅱ表達(dá)最低，表明缺氧條件下抑制HIF-1α 和ROS 水平可抑制肺癌細(xì)胞的自噬。NAC 和YC-1 單獨(dú)和聯(lián)合處理均可提高缺氧腫瘤細(xì)胞凋亡率，并抑制細(xì)胞侵襲能力。

綜上所述，缺氧條件下抑制HIF-1α/ROS 可通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞侵襲，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。