杜海英, 姜永莉, 韋英慣,3, 李金華, 盧日峰

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心長(zhǎng)春海關(guān)口岸門診部，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.廣西壯族自治區(qū)河池市疾病預(yù)防控制中心，廣西 河池 547000）

鹵代苯醌（halobenzoquinones，HBQs）是一類新型未受控水消毒副產(chǎn)物（disinfection byproducts，DBPs），在消毒處理后的飲用水和泳池水中均有檢出［1-2］。QIN 等［3］于2009 年首次在氯和氯胺消毒飲用水中檢出2，6-二氯-1，4-苯醌（2，6-dichloro-1，4-benzoquinone，2，6-DCBQ）。目前，在消毒水中已測(cè)得的HBQs 有12 種［1］。流行病學(xué)和定量構(gòu)效關(guān)系研究［4］表明：HBQs 是一類具有致癌風(fēng)險(xiǎn)的DBPs。HBQs 可觀察到的有害效應(yīng)最低水平 （lowest observed adverse effect levels，LOAELs）較常見的DBPs 如三鹵代甲烷和鹵代乙酸低1 000 倍［5］，表明HBQs 具有更強(qiáng)的毒性。HBQs 的毒性特征與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。HBQs 是一類結(jié)構(gòu)多樣的化合物，取代基團(tuán)的種類、數(shù)量和取代位置均會(huì)影響其毒性［6］。目前，關(guān)于HBQs 的研究尚不多見。因此，針對(duì)HBQs 類化合物定量結(jié)構(gòu)-毒 性 關(guān) 系 （quantitative structure-toxicity relationship，QSTR）的進(jìn)一步研究具有重要意義。本研究選取水DBPs 中的5 種HBQs，通過細(xì)胞毒性檢測(cè)獲取細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50），探討不同取代基HBQs 的QSTR，分析影響HBQs 細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)參數(shù)，為預(yù)測(cè)HBQs 潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2 細(xì)胞由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。2，6-DCBQ（CAS#697-91-6）、2，5-二溴-1，4-苯醌（2，5-dibromo-1，4-benzoquinone，2，5-DBBQ）（CAS#1633-14-3）和中性紅攝取試驗(yàn)（neutral red uptake，NRU）試劑盒（美國(guó)Sigma 公司），2，6-二溴-1，4-苯醌（2，6-dibromo-1，4-benzoquinone，2，6-DBBQ）（CAS#19643-45-9）和2，6-二氯-3-甲基-1，4- 苯 醌 （2，6-dichloro-3-methyl-1，4-benzoquinone，DCMBQ）（CAS#40100-98-9，加拿大TRC 公司），2，3，6-三氯-1，4-苯醌（2，3，6-trichlorocyclohexa-1，4- benzoquinone，TCBQ）（CAS#634-85-5，上海艾康睿醫(yī)藥科技有限公司），MTS 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promego 公司），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)Gibco 公司）。熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度為1×104mL－1，細(xì)胞懸液以每孔100 μL 的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組5 個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄原液，采用不同濃度HBQs 溶液作用細(xì)胞。HBQs 原液由甲醇（methanol，MeOH）溶解配制，稀釋后HBQs 溶液中MeOH 濃度均低于1.33%。采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（10%FBS+DMEM 培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（10%FBS+DMEM 培養(yǎng)基+1.33% MeOH）。

1.3 MTS 法檢測(cè)人肝癌HepG2 細(xì)胞存活率人肝癌HepG2 細(xì)胞給予不同濃度HBQs 培養(yǎng)24 h 后，于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入20 μL MTS 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，室溫下震蕩10 min，采用熒光酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。每個(gè)作用濃度重復(fù)試驗(yàn) 3 次，以log［HBQ］為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制劑量-反應(yīng)曲線。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白對(duì)照組A 值）/（陰性對(duì)照組A 值－空白對(duì)照組A 值）×100%。

1.4 NRU 法檢測(cè)人肝癌HepG2 細(xì)胞存活率人肝癌HepG2 細(xì)胞給予不同濃度HBQs 培養(yǎng)24 h 后，于96 孔培養(yǎng)板中每孔加入1%中性紅溶液20 μL，37 ℃孵育2 h，棄原液，PBS 緩沖液沖洗1 次，每孔加入50 μL 助溶劑（1%乙酸溶于50%MeOH），震蕩混勻10 min，采用熒光酶標(biāo)儀于540 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)A 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。每個(gè)作用濃度重復(fù)試驗(yàn)3 次，繪制劑量-反應(yīng)曲線。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白對(duì)照組A 值）/（陰性對(duì)照組A 值－空白對(duì)照組A 值）×100%。

1.5 HBQs 對(duì)人肝癌HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)采用OriginPro 8.5 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算不同濃度HBQs 作用24 h 時(shí)各組細(xì)胞IC50，即細(xì)胞存活率達(dá)到50%時(shí)抑制劑的濃度，并計(jì)算lgIC50。以各組細(xì)胞IC50代表HBQs 對(duì)人肝癌HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

1.6 HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)的選擇和計(jì)算根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］預(yù)測(cè)可能會(huì)影響HBQs 細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括辛醇-水分配系數(shù)（logP）、解離常數(shù)（pKa）、摩爾折射率（R）、摩爾表面積（S）、摩爾體積（V）、偶極矩（μ）、最高占據(jù)軌道能量（EHOMO）和最低未占軌道能量（ELUMO）。采用量子化學(xué)計(jì)算模塊MOPAC 計(jì)算各HBQs 的結(jié)構(gòu)參數(shù)。

1.7 QSTR 模型構(gòu)建采用單因素線性回歸分析方法，根據(jù)每種HBQs 的lgIC50和HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)構(gòu)建QSTR 模型，分析每種HBQs 的lgIC50與HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。每種HBQs 的IC50與HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)相關(guān)性分析采用單因素線性回歸分析方法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTS 法和NRU 法檢測(cè)HBQS 的作用濃度

MTS 法確定HBQs 的作用濃度：2，6-DCBQ為75、100、125、150、175、200、225 和250 μmol·L－1，DCMBQ 為175、200、225、250、275、300 和325 μmol·L－1，TCBQ 為200、225、250、275、300 和325 μmol·L－1，2，5-DBBQ 為75、100、125、150、175 和200 μmol·L－1，2，6-DBBQ為200、225、250、275、300 和325 μmol·L－1。NRU 法確定HBQs 的作用濃度：2，6-DCBQ 為25、50、75、100 和125 μmol·L－1，DCMBQ 為125、150、175、200、225 和250 μmol·L－1，TCBQ 為175、200、225、250、275 和300 μmol·L－1，2，5-DBBQ 為75、100、125、150 和175 μ mol·L－1，2，6-DBBQ 為125、150、175、200 和225 和250 μmol·L－1。

2.2 MTS 法檢測(cè)人肝癌HepG2 細(xì)胞存活率和IC50各組HepG2 細(xì)胞存活率隨HBQs 濃度的升高明顯降低，呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。見圖1。5 種HBQs 的 IC50見表1。以IC50代表細(xì)胞毒性，IC50越低，HBQs 的細(xì)胞毒性越大。5 種HBQs 對(duì)HepG2細(xì)胞毒性作用為 2，6-DCBQ＞2，5-DBBQ＞DCMBQ＞TCBQ＞2，6-DBBQ。

表1 MTS 法檢測(cè)HBQs 作用于HepG2 細(xì)胞的IC50Tab.1 IC50 of HBQs on HepG2 cells detected by MTS method（n=3）

圖1 MTS 法檢測(cè)各組HepG2 細(xì)胞存活率與HBQs 的劑量-反應(yīng)曲線Fig.1 Dose-response curves of survival rates of HepG2 cells and HBQs in various groups detected by MTS method

2.3 NRU 法檢測(cè)人肝癌HepG2 細(xì)胞存活率和IC50各組HepG2 細(xì)胞存活率，隨HBQs 濃度的升高明顯降低，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，見圖2。5 種HBQs 的 IC50見表2。5 種HBQs 對(duì)HepG2 細(xì)胞毒性作用為2，6-DCBQ＞2，5-DBBQ＞DCMBQ＞2，6-DBBQ＞TCBQ。

表2 NRU 法檢測(cè)HBQs 作用于HepG2 細(xì)胞的IC50Tab.2 IC50 of HBQs on HepG2 cells detected by NRU method（n=3）

圖2 NRU 法檢測(cè)各組HepG2 細(xì)胞存活率與HBQs 的劑量-反應(yīng)曲線Fig.2 Dose-response curves of survival rates of HepG2 cells and HBQs in various groups detected by NRU method

2.4 HBQs 的結(jié)構(gòu)參數(shù)采用量子化學(xué)計(jì)算模塊MOPAC 計(jì)算5 種HBQs 的結(jié)構(gòu)參數(shù)，HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)見表3。

表3 HBQs 的結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.3 Structural parameters of HBQs

2.5 單因素線性回歸分析QSTR 模型MTS 法和NRU 法檢測(cè)HBQs 的lgIC50與HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)之間相關(guān)性較低（R2＜0.5），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。由于DCMBQ 包含1 個(gè)甲基取代基和2 個(gè)鹵素取代基，而其他HBQs 僅包含鹵素取代基，DCMBQ 與其他HBQs 在結(jié)構(gòu)上存在差異，因此從總體數(shù)據(jù)中剔除了DCMBQ，再對(duì)4 種HBQs的lgIC50與HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行單因素線性回歸分析，MTS 法和NRU 法檢測(cè)4 種HBQs 的lgIC50與HBQs結(jié)構(gòu)參數(shù)之間相關(guān)性較低（R2＜0.5），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表4 MTS 和NRU 法檢測(cè)HBQs 的lgIC50 與HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)的相關(guān)性Tab.4 Correlations between lgIC50 of HBQs and structural parameters of HBQs detected by MTS and NRU methods

表5 MTS 和NRU 法檢測(cè)剔除DCMBQ 后HBQs 的lgIC50與HBQs 結(jié)構(gòu)參數(shù)的相關(guān)性Tab.5 Correlations between lgIC50 of HBQs and structural parameters of HBQs after removal of DCMBQ detected by MTS and NRU method

3 討 論

人肝癌HepG2 細(xì)胞有較完整的代謝酶，是進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)特別是遺傳毒物檢測(cè)中常用的細(xì)胞。目前關(guān)于HBQs 及其代謝產(chǎn)物尚未完全闡明，有研究［5］表明HBQs 具有潛在的遺傳毒性和致癌性。因此，本研究采用HepG2 細(xì)胞探討HBQs 的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果表明：5 種HBQs 對(duì)HepG2 細(xì)胞的作用濃度范圍差異較大，其檢測(cè)到最低有效作用濃度的差異較大，表明5 種HBQs 的細(xì)胞毒性存在顯著差異。采用MTS 法和NRU 法檢測(cè)每種HBQs 細(xì)胞毒性作用大小的順位結(jié)果基本一致，其差異在于2，6-DBBQ 和TCBQ 的細(xì)胞毒性大小不同，可能與兩種方法的檢測(cè)機(jī)制不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：與2，6-DBBQ 比較，2，5-DBBQ 對(duì)HepG2 細(xì)胞的毒性作用更大，表明在HBQs 的同分異構(gòu)體中，鹵素原子不同的取代位置可影響HBQs 類化合物的毒性，其毒性大小與鹵代原子的數(shù)量亦有相關(guān)性。ZUO 等［7］研究顯示：CHO-K1 細(xì)胞經(jīng)HBQs 染毒6、12 和24 h 后，2，5-DBBQ 和2，5-DCBQ 的細(xì)胞毒性均明顯高于相應(yīng)的2，6-HBQ 異構(gòu)體；且氯代HBQs 的細(xì)胞毒性隨1、2、3或4個(gè)氯取代基的存在而變化。LECURIEUX等［8］研究發(fā)現(xiàn)：在比較相同的異構(gòu)結(jié)構(gòu)時(shí)，HBQs 的氯代、溴代和碘代細(xì)胞毒性呈遞減趨勢(shì)，即二碘-HBQ ＞二溴- HBQ ＞二氯-HBQ。此結(jié)果與報(bào)道的其他DBPs 的細(xì)胞毒性一致，如鹵乙酸，其中碘乙酸＞溴乙酸＞氯乙酸［9-11］，該毒性順位存在于多種哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞系中，證實(shí)HBQs 的異構(gòu)結(jié)構(gòu)、取代原子種類和數(shù)量可以明顯影響其產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用。

化學(xué)物質(zhì)的理化性質(zhì)可影響其在細(xì)胞內(nèi)的吸收、代謝、生物轉(zhuǎn)化和在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究選取8 種可能會(huì)影響HBQs 細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)參數(shù)，并采用量子化學(xué)計(jì)算模塊MOPAC 計(jì)算HBQs 的結(jié)構(gòu)參數(shù)。ELUMO代表電子的親和度，與自由基代謝物形成的還原電位相關(guān)性較大［12-14］。LIU 等［15］使用雙參數(shù)多線性回歸分析評(píng)估ELUMO與HBQs 細(xì)胞毒性的相關(guān)性，結(jié)果表明兩者之間有較好的相關(guān)性。與ELUMO比較，EHOMO具有供電子能力，且與氧化電位相關(guān)性較大［16］。ELUMO和EHOMO均可代表氧化還原電位［17］。在芳香鹵代DBPs 的發(fā)育毒性比較研究［18］中發(fā)現(xiàn)：EHOMO是影響毒性比較重要的理化參數(shù)。反映分子的平均電荷分離和電子分布，S 和R均可用來描述分子的三維結(jié)構(gòu)［19］。QSTR 研究［20］顯示：R 與BQ 化合物誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞毒性呈中度相關(guān)。logP 描述了物質(zhì)在油質(zhì)與水質(zhì)兩相中的分配特點(diǎn)。PLEWA 等［10］研究發(fā)現(xiàn)：logP 與DBPs 的細(xì)胞毒性和遺傳毒性均具有較大相關(guān)性。但也有研究［7，21］認(rèn)為logP 與細(xì)胞毒性不相關(guān)，在QSTR 研究中，最常使用的定量分析方法是線性回歸分析［22］。本研究通過單因素多元線性回歸分析，采用MTS 法和NRU 法測(cè)得HBQs 的lgIC50與結(jié)構(gòu)參數(shù)之間相關(guān)性較低，未能建立起QSTR。這可能是由于樣本數(shù)較少，難以對(duì)結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的估計(jì)和計(jì)算，使分析結(jié)果產(chǎn)生較大的偏差。此外，在計(jì)算結(jié)構(gòu)參數(shù)前，需要將化合物的結(jié)構(gòu)圖規(guī)則化，否則會(huì)因手繪角度的差別而造成計(jì)算出的參數(shù)產(chǎn)生偏差，以致準(zhǔn)確值難以重現(xiàn)，使結(jié)構(gòu)參數(shù)值的計(jì)算結(jié)果不夠準(zhǔn)確和數(shù)據(jù)分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，HBQs 類化合物中鹵素原子的取代位置和種類可影響其對(duì)HepG2 細(xì)胞的毒性作用，苯環(huán)上鹵素的取代基數(shù)量也可影響其細(xì)胞毒性，并呈現(xiàn)鹵素取代越多其毒性越小的趨勢(shì)。