黃曉巍, 張思琪,, 張譯心, 劉 博, 王 鑫, 紀(jì)鳳蘭, 楊潤澤,, 徐惠波, 丁 濤

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)實驗室，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院藥效毒理評價中心，吉林 長春 130012；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，吉林 長春 130033）

病證結(jié)合動物模型是連接中醫(yī)藥臨床研究和基礎(chǔ)研究的紐帶，是基于疾病模型對動物宏觀體征進行動態(tài)觀察，并結(jié)合微觀指標(biāo)判別建立的符合臨床證候特點的動物模型。目前在探索建立病證結(jié)合動物模型的評價標(biāo)準(zhǔn)時通常結(jié)合經(jīng)典生化指標(biāo)進行綜合評價，但部分證候模型的發(fā)生機制尚不明確。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠從分子水平上篩選證候相關(guān)基因，并結(jié)合生物信息學(xué)方法探索基因相互調(diào)控規(guī)律，為證候發(fā)生和演變的物質(zhì)基礎(chǔ)提供新思路，如常見的陰虛證必然存在與細(xì)胞生長、凋亡和糖脂代謝有關(guān)基因的變化［1-4］。消渴靈片主要由黃芪、黃連和麥冬等11 味中藥組成，具有滋補腎陰、生津止渴和益氣降糖的功效，可以改善2 型糖尿病患者氣陰兩虛證候表現(xiàn)。本課題組前期研究［5］依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［6］中患者臨床表現(xiàn)，初步建立氣陰兩虛型2 型糖尿病病證結(jié)合動物模型［6］，以消渴靈片作為該模型的佐證藥，初步證實該病證結(jié)合動物模型基本符合氣陰兩虛型2 型糖尿病的臨床證候特點。本研究在此基礎(chǔ)上采用高通量測序技術(shù)，對氣陰兩虛型2 型糖尿病相關(guān)證候基因進行研究，從mRNA 表達水平篩選差異基因，結(jié)合宏觀表征和生化指標(biāo)探討氣陰兩虛型2 型糖尿病證候特征與差異表達基因的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器SPF 級雄性SD 大鼠49 只，體質(zhì)量150～170 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）-2015-0001。消渴靈片（云南白藥集團股份有限公司），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美國Sigma 公司）。普通飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司），高糖高脂飼料（KK 鼠料，北京華阜康生物科技股份有限公司），檸檬酸鈉和檸檬酸（北京化工廠），環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）、CD4 和CD8試劑盒（美國RD 公司），RNA 超快速文庫制備試劑盒、Poly（A）mRNA 磁性分離試劑盒、多重寡核苷酸（引物1）和多重寡核苷酸（引物2）（美國新英格蘭生物實驗室有限公司），RNA 6000 Pico 芯片、DNA 試劑盒和RNA 6000 Nano 芯片（美國安捷倫科技有限公司），QubitTMRNA 寬范圍（BR）、QubitTMDNA 寬范圍（BR）和QubitTMDNA 高靈敏度試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司），KAPA SYBR FAST qPCR 預(yù)混液、DNA 定量標(biāo)準(zhǔn)品和引物預(yù)混試劑盒（美國KAPA Biosystem 公司）。pH 計［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，型號PB-10］，血糖儀（中國深圳家康科技有限公司，型號BGM506），大鼠抓力測定儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院濟南益延科技發(fā)展有限公司，型號YLS-13A），多導(dǎo)生物記錄儀（澳大利亞ADInstruments 公司，型號PowerLab/8S），低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司，型號DT5-3），數(shù)碼相機（日本富士公司，型號HS11），酶標(biāo)儀（美國Bio Tek 公司，型號ELx800），全自動生化分析儀（長春迪瑞實業(yè)有限公司，型號CS-600B），歐姆龍紅外額式體溫計［歐姆龍健康醫(yī)療（中國）有限公司，型號MC-872］，96 孔熱循環(huán)器（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號B01-02），生物分析儀2100（美國安捷倫科技有限公司，型號J06-02），QUBIT 2.0 熒光計（美國賽默飛世爾科技公司，型號Q32871），高通量PCR 儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號B01-01）。

1.2 實驗動物分組、造模和給藥隨機選取18 只雄性SD 大鼠作為空白組（喂食普通飼料），其余大鼠高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射35 mg·kg－1STZ 建立2 型糖尿病大鼠模型。于實驗第6 周根據(jù)血糖和體質(zhì)量均衡原則將造模成功的31 只大鼠分為模型組（n=14）和藥物佐證組（n=17），模型組大鼠繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，藥物佐證組大鼠灌胃消渴靈2.2 g·kg－1·d－1，實驗進行至第21 周。

1.3 大鼠一般狀態(tài)的采集方法和評分參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［6］中氣陰兩虛型2 型糖尿患者臨床研究證候表現(xiàn)，分別采用體質(zhì)量、進食量、飲水量、精神狀態(tài)評分、運動評分、足溫、抓力、脈搏幅度、呼吸頻率和舌象積分指標(biāo)評價模型大鼠口渴喜飲、多食易饑、倦怠乏力、氣短懶言、五心煩熱和舌紅脈細(xì)的證候表現(xiàn)，運動和精神狀態(tài)評分具體方法見參考文獻［5］。

1.4 各組大鼠體質(zhì)量、進食量、飲水量、足溫、抓力、脈搏幅度、呼吸頻率和舌象積分檢測每4 周稱量1 次大鼠體質(zhì)量，每3 周記錄1 次大鼠24 h 進食量和飲水量。分別于第0 周和第21 周檢測各組大鼠抓力、呼吸頻率、脈搏幅度和足溫，于第21 周檢測各組大鼠舌體顏色，具體測定方法見參考文獻［5］。

1.5 各組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平檢測于實驗第0 周和第21 周進行尾靜脈采血，采用血糖儀直接檢測各組大鼠FBG 水平。

1.6 各組大鼠血清中血脂指標(biāo)水平檢測于第21 周大鼠腹主動脈采血，靜置30 min后，3 000 r·min－1離心15 min，取上層血清，采用氧化酶法檢測各組大鼠血清中甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol ，TC）水平，直接法檢測各組大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）水平。

1.7 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平各組選取8 只大鼠，于第21 周大鼠腹主動脈采血，靜置30 min 后，3 000 r·min－1離心15 min，取上層血清，根據(jù)試劑盒操作方法檢測血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平。檢測步驟如下：在預(yù)先包被CD4、CD8、cAMP 和cGMP 抗體的包被鎖孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品和辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。采用底物TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平呈正相關(guān)關(guān)系。采用酶標(biāo)儀于波長450 nm 處檢測吸光度（A）值。以A 值代表各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平。

1.8 轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測大鼠差異表達基因組織樣品制備：取3 組大鼠肝組織樣品放入離心管中，用液氮速凍，－80 ℃冰箱凍存。采用Quibt RNA 試劑盒對肝組織中總RNA （Total RNA）定量，依據(jù)RIN≥7，28S 和18S 的RNA 比值≥1.5∶1，采用Agilent 2100 檢測RNA 完整性，選取質(zhì)控合格的RNA 用于后續(xù)分析。建庫：經(jīng)mRNA 純化和片段化、一鏈合成、二鏈合成、末端修復(fù)和加dA 尾、Adaptor 連接、PCR 擴增及PCR 產(chǎn)物質(zhì)控后混合文庫。測序：采用illumina 測序平臺檢測獲取原始基因序列，再經(jīng)過濾和統(tǒng)計后得到用于后續(xù)分析的基因序列，將得到的基因序列與參考基因序列比對、分類、組裝和定量。采用DESeq 軟件計算模型組與空白組和模型組與藥物佐證組組間差異表達情況，將差異倍數(shù)|log2FC|≥1 且顯著性水平P≤0.05的基因判定為差異表達基因，組間的差異基因分布情況以火山圖表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠精神狀態(tài)評分、運動評分、體質(zhì)量、進食量、飲水量、足溫、抓力、脈搏幅度、呼吸頻率、舌象積分、FBG 和血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c、CD4、CD8、cAMP 及cGMP 水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用兩獨立樣本LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)指標(biāo)在第21 周時，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01），進食量、飲水量和足溫明顯升高（P＜0.01），精神狀態(tài)評分、運動評分和舌象積分明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），抓力和脈搏幅度明顯減小（P＜0.01），呼吸頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，藥物佐證組大鼠體質(zhì)量、進食量和飲水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），精神狀態(tài)評分、運動評分和舌象積分明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），足溫明顯降低 （P＜0.01），抓力和脈搏幅度明顯增大（P＜0.01），呼吸頻率有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1～4。

表1 各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body masses of rats in various groups( ±s，m/g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body masses of rats in various groups( ±s，m/g）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs blank group.

Group n Body mass 21 612.71±62.93 462.57±73.30**486.79±67.55(week) 1 254.09±9.32 255.14±14.65 246.83±9.56 5 9 Blank Model Drug evidence 18 14 17 463.67±40.55 424.60±39.23*435.32±28.63 519.73±48.51 436.36±53.88**440.85±46.28 13 555.86±65.17 447.32±63.67**467.01±56.26 17 599.91±62.44 460.39±72.43**471.45±61.51

表2 各組大鼠日進食量和飲水量Tab.2 Daily food intakes and water intakes of rats in various groups（±s）

表2 各組大鼠日進食量和飲水量Tab.2 Daily food intakes and water intakes of rats in various groups（±s）

*P＜0.01 vs blank group.

Group n Food intakes (g·d－1)9 Blank Model Drug evidence 18 14 17(week) 6 29.11±0.62 33.89±0.98*33.55±1.54 27.55±2.18 37.54±4.45*38.49±0.89 12 24.43±2.96 35.63±5.56*35.01±1.16 15 26.48±4.55 36.69±5.78*37.19±3.06 18 29.07±1.11 35.05±4.83*37.55±2.73 21 23.18±1.96 34.10±3.69*33.30±2.96 Group n Water intake (mL·d－1)21 42.19±10.92 155.60±12.61*154.41±25.52 18 14 17 9 Blank Model Drug evidence(week) 6 47.63±7.90 156.19±11.26*156.42±7.69 46.31±3.13 189.49±21.61*185.39±10.72 12 34.81±12.27 168.18±31.42*150.34±7.09 15 37.75±23.39 178.39±33.98*183.47±22.98 18 48.13±8.19 174.88±25.54*158.53±27.88

表3 各組大鼠精神狀態(tài)評分、運動評分、足溫、抓力、呼吸頻率和脈搏幅度Tab.3 Mental state scores, sport scores, foot temperatures, griping force, respiratory rates,and pulse amplitudes of rats in various groups（±s）

表3 各組大鼠精神狀態(tài)評分、運動評分、足溫、抓力、呼吸頻率和脈搏幅度Tab.3 Mental state scores, sport scores, foot temperatures, griping force, respiratory rates,and pulse amplitudes of rats in various groups（±s）

*P＜0.01 vs blank group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.

Group n Mental state score(week) 21 0.11±0.32 1.86±0.36*1.41±0.51△Griping force(m·g－1)Sport score 21 0.11±0.32 1.93±0.27*1.35±0.49△△Foot temperature(θ/℃)0 32.47±3.27 30.76±1.36 31.10±1.51 0 Blank Model Drug evidence 18 14 17 21 29.92±1.36 31.88±1.94*29.53±1.51△△21 1 994.56±1.39 1 590.20±78.57*1 722.35±101.37△△Group n Blank Model Drug evidence Respiratory rate (times·min－1)(week) 0 96.04±12.90 94.49±17.82 102.19±18.84 21 0.018±0.006 0.008±0.003*0.017±0.011△△18 14 17 21 97.23±19.29 95.54±20.96 108.65±20.34 1 136.96±118.12 1 123.04±106.44 1 117.39±122.89 Pulse amplitude(U·V－1)0 0.013±0.005 0.014±0.005 0.021±0.017

表4 各組大鼠舌象積分Tab.4 Tongue image integral of rats in various groups（±s）

表4 各組大鼠舌象積分Tab.4 Tongue image integral of rats in various groups（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs blank group；△P＜0.01 vs model group.

Group Blank Model Drug evidence Blue 27.00±2.41 38.15±5.97**21.71±6.15△n 18 14 17 Red 88.90±5.19 98.86±9.47*82.67±4.51△Green 22.38±6.76 30.53±6.93*13.87±6.02△

2.2 各組大鼠FBG水平和血清中TC、TG、LDL-c及HDL-c 水平與空白組比較，模型組大鼠FBG 水平和血清中TC、TG 及LDL-c 水平明顯升高（P＜0.01），HDL-c 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，藥物佐證組大鼠FBG 水平和血清中TC、TG、LDL-c 及HDL-c 水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5 和6。

表5 各組大鼠FBG 水平Tab.5 FBG levels of rats in various groups[±s,сB/(mmol·L－1)]

表5 各組大鼠FBG 水平Tab.5 FBG levels of rats in various groups[±s,сB/(mmol·L－1)]

*P＜0.01 vs blank group.

Group n Blank Model Drug evidence Fasting blood glucose(week) 0 4.12±0.48 4.16±0.44 4.10±0.42 21 5.46±0.44 20.09±5.36*17.61±3.77 18 14 17

表6 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 水平Tab.6 Levels of TC, TG, LDL-c, and HDL-c in serum of rats in various groups [±s,сB/(mmol·L－1)]

表6 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 水平Tab.6 Levels of TC, TG, LDL-c, and HDL-c in serum of rats in various groups [±s,сB/(mmol·L－1)]

*P＜0.01 vs blank group.

Group Blank Model Drug evidence HDL-c 0.99±0.16 1.05±0.28 0.96±0.25 n 18 14 17 TC 1.96±0.40 8.38±2.06*8.35±4.72 TG 1.53±0.44 13.28±5.56*12.69±4.97 LDL-c 0.73±0.11 6.44±1.91*5.60±3.50

2.3 各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP水平與空白組比較，模型組大鼠血清中CD4 水平和CD4/CD8 比值均明顯降低（P＜0.01），CD8水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），cAMP 水平及cAMP/cGMP 比值均明顯升高（P＜0.01），cGMP水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，藥物佐證組大鼠血清中CD4 水平及CD4/CD8 比值均明顯升高（P＜0.01），CD8 和cAMP 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），cGMP 水平明顯升高（P＜0.01），cAMP/cGMP 比值明顯降低（P＜0.01）。見表7。

表7 各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平及CD4/CD8 和cAMP/cGMP 比值Tab.7 Levels of CD4,CD8,cAMP,cGMP, and CD4/CD8 and cAMP/cGMP in serum of rats in various groups(n=8，±s）

表7 各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平及CD4/CD8 和cAMP/cGMP 比值Tab.7 Levels of CD4,CD8,cAMP,cGMP, and CD4/CD8 and cAMP/cGMP in serum of rats in various groups(n=8，±s）

*P＜0.01 vs blank group；△P＜0.01 vs model group.

Group CD4/CD8 cAMP/cGMP Blank Model Drug evidence CD4[ρB/(μg·L－1)]85.88±11.78 66.25±10.15*84.34±10.25△CD8[ρB/(μg·L－1)]47.05±6.82 42.03±3.51 41.40±4.78 0.13±0.01 0.22±0.03*0.15±0.01△1.83±0.17 1.57±0.18*2.04±0.20△cAMP[сB/nmol·L－1)]12.18±1.85 14.67±0.83*13.96±1.33 cGMP[сB/nmol·L－1)]92.35±17.15 68.98±9.14*91.18±8.78△

2.4 各組大鼠差異表達基因與空白組比較，模型組大鼠差異表達基因共922 個，上調(diào)基因520 個（紅色），下調(diào)基因402 個（綠色）。見圖1A。與模型組比較，藥物佐證組大鼠差異表達基因共136 個，上調(diào)基因68 個（紅色），下調(diào)基因68 個（綠色）。見圖1B。

圖1 各組大鼠差異表達基因Fig.1 Differential expressed genes of rats in various groups

與空白組比較，模型組大鼠有520 個上調(diào)差異表達基因，其中涉及代謝的基因為早期生長應(yīng)答因子2（early growth response factor 2，Egr2），參與細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)的基因有Ppp2r2b、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1 （insulin-like growth factor binding protein 1，Igfbp1）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶4 （a disintegrin and metallopeptidase with thrombospondin motfis 4，Adamts4）、Rgs16、Gadd45b、Rasgef1b、Egr2、Fosb、Slc25a22、Bcl6 和Wfdc6a，目前生物學(xué)過程不明確的基因有AABR07065768.3、AABR07027447.1、AABR07051548.2、AABR07061134.1、RF00100、AABR07065782.1、LOC100911994、Serhl2、AABR07065750.3、RF00560、AABR07051716.2、RF00405、RF00026、AABR07029863.2 和RF00398，藥物佐證組有27 個下調(diào)基因。見表8。與空白組比較，模型組大鼠有402 個下調(diào)表達基因，其中涉及代謝的基因有G0/G1開關(guān)2（G0/G1swich 2，G0s2）、中線1 相互作用蛋白 1 （midline 1 interaction protein 1，Mid1ip1）、Angptl8 和Fgf21，參與細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)的基因有螺旋-環(huán)-螺旋家族成員e40 （basic helix-1oop-helix familye 40，Bhlhe40）、Irx5、Ier5、Mdk、Hyls1、Spata2L 和Rpp3，目前生物過程不明確的基因有RF00420、Mir3554、RF00425、RF00601、RF00019 和RF00026，藥物佐證組有17 個上調(diào)基因。見表9。

表8 模型組大鼠差異表達基因Tab.8 Differential expressed genes in model group

3 討 論

病證結(jié)合是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)診療疾病常采用的模式，也是證候本質(zhì)研究的重要方法。病證結(jié)合動物模型是探索中醫(yī)理論的載體，對于探討疾病病理變化和中醫(yī)證候特征具有較大優(yōu)勢。因此，建立符合臨床特點的病證結(jié)合動物模型和評價標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)探尋證候機制，能夠為豐富中醫(yī)證候的現(xiàn)代化研究提供更多的理論依據(jù)。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將糖尿病歸類于“消渴病”，糖尿病患者多見氣陰兩虛，基本病機為陰津虧損，燥熱偏盛，陰虛日久，傷津耗氣，而致氣陰兩虛［7-8］。消渴靈具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴和益氣降糖的功效，可用于改善氣陰兩虛型2 型糖尿病患者的證候表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、倦怠乏力、消瘦、渴而多飲、煩熱、饑而欲食及舌質(zhì)紅脈虛弱的表現(xiàn)；藥物佐證組大鼠灌胃21 周后，與模型組比較，其精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，倦怠乏力和舌質(zhì)紅脈虛弱癥狀明顯改善，證實模型組從生理特征方面基本體現(xiàn)了氣陰兩虛型2 型糖尿患者的臨床特點。

機體證候變化時，除生理指標(biāo)外，生化指標(biāo)也會出現(xiàn)變化。CD4 和CD8 水平是反映氣虛證候的重要標(biāo)志［9-10］。本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清中CD4 水平降低，在佐證藥消渴靈干預(yù)后模型組大鼠CD4 水平升高，表明模型組大鼠證候表現(xiàn)與免疫功能低下有關(guān)。環(huán)核苷酸cAMP 和cGMP 是相互拮抗的2 種物質(zhì)，為生物體內(nèi)的第二信使，共同調(diào)控機體能量代謝水平［11］。當(dāng)機體出現(xiàn)陰虛表現(xiàn)時，cAMP 水平升高，cAMP/cGMP 比值升高，因此二者常作為反映陰虛的重要指標(biāo)［12-14］。研究［15］表明：cAMP 通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信號促進糖異生相關(guān)蛋白磷酸化，促進糖異生。本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠FBG 水平和血清中cAMP 水平及cAMP/cGMP 比值升高，cGMP 水平降低，TC、TG 和LDL-c 水平升高，表明模型組大鼠出現(xiàn)了糖脂代謝異常，結(jié)合上述消瘦及渴而多飲等生理表現(xiàn)，大鼠反映出糖尿病的狀態(tài)；藥物佐證組大鼠灌胃21 周后，與模型組比較，藥物佐證組大鼠血清中cGMP 水平升高，cAMP/cGMP 比值降低，內(nèi)分泌功能的失衡得以改善。進一步證實模型組動物狀態(tài)基本體現(xiàn)了氣陰兩虛型2 型糖尿病的證候特點。

肝臟是機體物質(zhì)代謝樞紐，是機體的主要代謝器官［16］。本研究結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠主要上調(diào)表達基因有Igfbp1、Adamts4 和Egr2 等，主要下調(diào)表達基因有Bhlhe40、Mid1ip1和G0s2 等。其中Igfbp1 在自身性免疫疾病中高表達，還可通過腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激Igfbp1 與胰島素樣生長因子1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1）結(jié)合，導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞增殖分化受限，降低機體免疫力［17-18］。Adamts4 可增加腫瘤細(xì)胞的浸潤程度進而使腫瘤發(fā)生遷移，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展多伴隨機體免疫功能異常，即免疫力下降［19-20］。研究［21］顯示：Igfbp1 除參與免疫調(diào)節(jié)外，對機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)也起重要作用，Igfbp1 過表達能夠抑制IGF-1 的降糖作用使FBG 水平升高；Mid1ip1 是由碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)葡萄糖反應(yīng)的基因之一，并且通過負(fù)調(diào)控AMP 活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）減少脂質(zhì)的沉積［22-23］；G0s2 對脂質(zhì)降解具有抑制作用［24］；Egr2表達上調(diào)可促進脂質(zhì)沉積［25-26］。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠血糖和血脂水平升高，可能與上述基因水平的變化有關(guān)聯(lián)，表明氣陰兩虛型2 型糖尿病大鼠模型的證候表現(xiàn)也體現(xiàn)在機體的代謝紊亂。本研究結(jié)果表明：佐證藥消渴靈對氣陰兩虛型2 型糖尿病大鼠模型的證候生理體征表現(xiàn)及免疫功能的改善明顯，對能量代謝指標(biāo)cAMP 和cGMP 水平也有一定調(diào)控作用，但對血糖和血脂水平改變效果不明顯。提示中藥對疾病的治療多體現(xiàn)在整體宏觀的調(diào)節(jié)，增加機體對疾病的抵抗能力。

綜上所述，氣陰兩虛型2 型糖尿病病證結(jié)合大鼠模型的證候表現(xiàn)可能與Egr2、Igfbp1 和Adamts4基因上調(diào)及G0s2、Mid1ip1 和Bhlhe40 基因下調(diào)有關(guān)聯(lián)。