林 喆, 王泰棟, 黃曉巍, 馬 超, 莊雪峰, 王雨辰, 林 賀, 郭駿騏, 律廣富

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院中藥藥理組，吉林 長春130117）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以侵蝕性、對稱性、多關(guān)節(jié)性和滑膜慢性炎癥為主要特征的全身性自身免疫性疾病，全世界類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患病率約為1.0%，我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患病率約為0.3%［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于“痹證”范疇，此病的發(fā)生與感受風(fēng)、寒、濕、熱等外邪有關(guān)，中醫(yī)多采用活血養(yǎng)陰、扶正祛邪及祛風(fēng)除濕等中藥治療方法［2］。防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)的干燥根部，味辛、微甘，性溫，歸肝、膀胱和脾經(jīng)，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛及止痙的作用［3］。中醫(yī)應(yīng)用防風(fēng)的歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》［4］將其列為上品，用于感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢和破傷風(fēng)等癥的治療。中醫(yī)古籍研究［5］顯示：在歷代醫(yī)家治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方劑中，防風(fēng)常作為基礎(chǔ)組方之一出現(xiàn)。目前栽培品中藥材已成為臨床應(yīng)用主流，但由于各地區(qū)環(huán)境氣候的差異，栽培品中藥材的質(zhì)量良莠不齊，甚至有些中藥材出現(xiàn)同種不同效的現(xiàn)象，極大降低了中藥材的臨床應(yīng)用效果。本研究采用防風(fēng)野生品作為實(shí)驗(yàn)對象，避免由于栽培品的差異導(dǎo)致臨床應(yīng)用效果不均，最大程度反映中藥材防風(fēng)的傳統(tǒng)功效和藥理作用，為防風(fēng)的臨床應(yīng)用和精準(zhǔn)培育提供參考［6］。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是一種與炎癥因子生成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子［7］。研究［8］顯示：NFκB 過度活化所引起的前炎性細(xì)胞因子合成和釋放是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素。盡管防風(fēng)在多種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方劑中均有應(yīng)用，但目前關(guān)于防風(fēng)單味藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究較少，且其作用機(jī)制尚不明確。本研究探討防風(fēng)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用及其對NF-κB 信號通路的影響，為防風(fēng)在臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、主要試劑和儀器健康6～8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（200±20）g，由長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-（吉）-2020-0002。大鼠飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物室，飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查，符合實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理規(guī)范，倫理編號：2021247。牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑（德國Sigma 公司，批號：C7806 和BJ-012-0392），防風(fēng)野生品（由白山職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供，經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室鑒定，批號：20200901），地塞米松（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司），戊巴比妥鈉（廣州化學(xué)試劑廠），白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、白 細(xì) 胞 介 素 6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，貨號：MM-0047R1、MM-0190R1 和MM-0180R1），NF-κB p65、NF-κB 抑制因子α （NF-κB inhibitor protein-α，IκB-α）、IκB-α 激酶β（IκB-α kinase-β，IKK-β）及環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）一抗和二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號：10745-1-AP、10268-1-AP、15649-1-AP、26593-1-AP 和SA00001-2），TNF-α 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL01581），RIPA 裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0013B 和P0010），蛋白酶抑制劑混合液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號：GRF101），苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號：G2008）。冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：TGL-16），Invitrogen iBright成像系統(tǒng)（美國Thermo公司，型號：CL750），PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-Rad 公司，型號：1645050）。

1.2 防風(fēng)水煎液制備防風(fēng)野生品陰干，切制后得飲片500 g，后于陶瓷煎藥鍋中用水浸泡30 min，浸泡過后煎煮30 min，最后濃縮至1 g·mL－1。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組、造模和給藥50 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組，每組10 只。除對照組外，其余各組大鼠制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型。稱取5 mgⅡ型膠原，采用0.1 mol·L－1冰醋酸于冰水浴中，定容于25 mL 容量瓶中，4 ℃靜置過夜，隨后將制好的溶液與25 mL 弗氏完全佐劑于冰水浴中混勻乳化制成0.1 g·L－1膠原乳劑，在大鼠尾根部和左后足跖處兩點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 mL 膠原乳劑，共0.2 mL，10 d 后進(jìn)行二次免疫，大鼠左足明顯紅腫和體積增大表明造模成功。對照組大鼠注射等量注射用水，其余操作與實(shí)驗(yàn)組大鼠一致［9］。

造模結(jié)束后低劑量防風(fēng)組大鼠以0.45 g·kg－1劑量灌胃給藥，高劑量防風(fēng)組大鼠以0.90 g·kg－1劑量灌胃給藥，地塞米松組大鼠灌胃2 mg·kg－1地塞米松混懸液，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，共計(jì)給藥14 d。

1.4 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分檢測治療前后采用關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)各組大鼠的左后足AI。評分標(biāo)準(zhǔn)：足關(guān)節(jié)無明顯紅腫計(jì)0 分；趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫計(jì)1 分；趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹計(jì)2 分；踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹計(jì)3 分；全部足爪腫脹計(jì)4 分。

1.5 各組大鼠足腫脹程度檢測于造模結(jié)束后和末次給藥后，采用手術(shù)線環(huán)繞各組大鼠左下足跖部位，以手術(shù)線環(huán)繞1 周的長度作為大鼠足跖圍，直尺測量各組大鼠足跖圍變化，以各組大鼠的足跖圍判定足腫脹程度。

1.6 各組大鼠臟器指數(shù)計(jì)算處死各組大鼠，取脾臟和胸腺，采用生理鹽水沖洗后瀝干水分，記錄各組大鼠脾臟和胸腺質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)＝器官質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量，單位為mg·100 g－1。

1.7 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后進(jìn)行腹主動脈取血，3 500 r·min－1低溫離心10 min，分離血清，－20 ℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1.8 HE 染色觀察各組大鼠滑膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分離大鼠踝關(guān)節(jié)，剔除周圍組織，取包埋后的踝關(guān)節(jié)進(jìn)行石蠟切片，隨后將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，HE 染色后光鏡下觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.9 Western blotting 法檢測各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平大鼠取血后，分離左足關(guān)節(jié)滑膜組織，置入EP 管中，液氮中保存。將40 mg 大鼠滑膜組織勻漿，并在RIPA 裂解緩沖液中裂解。12 000 r·min－1、4 ℃ 離心10 min，收集上清，采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，－80 ℃保存?zhèn)溆?。制備SDS PAGE 凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，封閉，孵育一抗和二抗。采用ECL 化學(xué)發(fā)光法于成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平= 目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠AI 評分，足腫脹程度，臟器指數(shù)，血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平及滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠AI評分 與對照組比較，模型組大鼠AI 評分明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組大鼠AI 評分明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠AI 評分Tab.1 AI scores of rats in various groups (n=10，ˉ±s）

表1 各組大鼠AI 評分Tab.1 AI scores of rats in various groups (n=10，ˉ±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Radix AI score 0.00±0.00 2.40±0.49*1.00±0.00△1.00±0.00△1.40±0.49△

2.2 各組大鼠足腫脹程度與對照組比較，模型組大鼠足腫脹程度明顯加重（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組大鼠足腫脹程度明顯減輕（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠足腫脹程度Tab.2 Swelling degrees of feet of rats in various groups(n=10，ˉ±s，l/cm）

表2 各組大鼠足腫脹程度Tab.2 Swelling degrees of feet of rats in various groups(n=10，ˉ±s，l/cm）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Foot circum ference Before treatment 2.49±0.09 3.03±0.19*3.04±0.24*3.01±0.17*After treatment 2.44±0.05 2.76±0.21*2.30±0.10△△2.54±0.05△Radix 3.04±0.21*2.56±0.09△

2.3 各組大鼠臟器指數(shù)與對照組比較，模型組大鼠胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組大鼠胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。各組大鼠脾臟指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠臟器指數(shù)Tab.3 Organ indexes of rats in various groups （n=10，ˉ±s，mg·100 g－1)

表3 各組大鼠臟器指數(shù)Tab.3 Organ indexes of rats in various groups （n=10，ˉ±s，mg·100 g－1)

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Radix Thymus index 0.004 7±0.003 2 0.013 1±0.002 9*0.005 6±0.003 1△0.012 3±0.002 3△0.011 0±0.003 1△Spleen index 0.017 6±0.001 2 0.017 6±0.002 5 0.017 7±0.001 9 0.015 3±0.001 9 0.017 0±0.002 1

2.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，ˉ±s，ρB/(ng·L－1)］

表4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，ˉ±s，ρB/(ng·L－1)］

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Radix IL-6 23.85±1.68 70.93±8.31*38.10±2.76△59.34±6.53△46.88±5.08△TNF-α 30.46±2.48 85.67±9.25*45.58±5.63△65.72±7.52△60.45±6.83△IL-1β 48.36±3.67 105.62±15.71*60.92±5.78△77.23±8.03△69.55±7.36△

2.5 各組大鼠滑膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠滑膜組織未見異常；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生程度減輕且炎癥細(xì)胞數(shù)減少。見圖1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Morphology of synovial tissue of ankle joint of rats in various groups（HE，×200）

2.6 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中NF-κB、IKK-β 、COX-2 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），IκB-α蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風(fēng)組和高劑量防風(fēng)組大鼠滑膜組織中NF-κB、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），IκB-α 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖2 和3。

圖2 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB,IκB-α,IKK-β,COX-2, and TNF-α proteins in synovial tissue of rats in various groups

圖3 各組大鼠滑膜組織NF-κB(A)、IκB-α(B)、IKK-β(C)、COX-2(D)和TNF-α(E)蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of NF-κB(A), IκB-α(B), IKK-β(C), COX-2(D), and TNF-α(E) proteins in synovial tissue of rats in various groups

3 討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理學(xué)表現(xiàn)為滑膜組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨損傷和骨侵蝕［10-12］。因此，減輕滑膜炎癥反應(yīng)和抑制滑膜異常增生是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效方法［13］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型是一種可靠且與人類病理狀態(tài)相似的動物模型［14］。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)明顯腫脹，AI 評分明顯升高，滑膜組織增生并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型制備成功，而地塞米松組和不同劑量防風(fēng)組能夠明顯減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，降低AI 評分，抑制滑膜組織增生，降低炎癥細(xì)胞數(shù)量，表明防風(fēng)能夠有效緩解大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。脾臟和胸腺作為機(jī)體兩大免疫器官在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［15-16］。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠胸腺指數(shù)升高，經(jīng)防風(fēng)給藥后大鼠胸腺指數(shù)降低，表明防風(fēng)能夠緩解由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的免疫器官腫大，因此認(rèn)為防風(fēng)野生品能夠通過抑制機(jī)體過度免疫應(yīng)答對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎起到治療作用。TNF-α、IL-1β 和IL-6 被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中重要的促炎細(xì)胞因子，參與關(guān)節(jié)組織炎癥形成和關(guān)節(jié)破壞［17-18］。研究［19-21］顯示：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 高于正常水平，且類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度與TNF-α、IL-6和IL-1β 水平呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果顯示：防風(fēng)野生品能夠降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)，表明防風(fēng)野生品對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，該作用與防風(fēng)野生品抑制機(jī)體異常免疫應(yīng)答及降低炎性因子水平有關(guān)。

NF-κB 在多種自身免疫性疾病中被活化，其中包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［22-23］。NF-κB 被激活后能夠通過調(diào)控細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子等途徑參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，激活后的NF-κB 釋放入核還能夠繼續(xù)誘導(dǎo)下游COX2、TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)［24-28］。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中NF-κB 和IKK-β 蛋白表達(dá)水平升高，IκB-α 蛋白表達(dá)水平降低，表明在大鼠滑膜組織中NF-κB信號通路被激活，而不同劑量防風(fēng)組大鼠滑膜組織中NF-κB 和IKK-β 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低，IκB-α 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯升高，表明大鼠滑膜組織NF-κB 信號通路的激活得到有效抑制。

綜上所述，防風(fēng)野生品對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有較好的治療效果，其通過降低血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，抑制滑膜組織中NFκB 信號通路的過度激活，從而發(fā)揮治療作用。