王星燁, 孔祥日, 金夢(mèng)麗, 王冰梅, 黎明全

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦病科，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130117；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院生理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種年齡相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病，隨著人口年齡結(jié)構(gòu)的改變，AD 患病率逐年升高，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大壓力。研究［1-2］顯示：AD 發(fā)病機(jī)制源于突觸功能障礙，進(jìn)而相繼形成β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）及磷酸化tau 蛋白過(guò)度聚集。神經(jīng)炎癥在AD 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，以促炎細(xì)胞因子釋放、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征。研究［3-4］顯示：神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。當(dāng)發(fā)生神經(jīng)炎癥時(shí)，免疫細(xì)胞被激活從而釋放大量有毒細(xì)胞因子至外周神經(jīng)元中，并進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)疾病進(jìn)展［5-7］。因此，抑制神經(jīng)炎癥可能是緩解神經(jīng)退行性疾病的有效措施。

白細(xì)胞介素17 （interleukin-17，IL-17）是一種主要的促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)對(duì)病原體或組織損傷的反應(yīng)，并驅(qū)動(dòng)自身免疫性疾?。?］。研究［9］顯示：IL-17 可能在各種神經(jīng)退行性疾病中起重要作用。白細(xì)胞介素17A （interleukin-17A，IL-17A）為IL-17 家族成員的配體。轉(zhuǎn)錄因子p53 作用于細(xì)胞周期控制、DNA 損傷反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程，維持基因組完整性。p53 蛋白能保持基因組的穩(wěn)定性，避免或減少基因突變的發(fā)生，是防止神經(jīng)元退化的各種補(bǔ)償或防御機(jī)制的基礎(chǔ)［10］。β-谷甾醇是一種植物甾醇，廣泛分布于多種油料性植物及中藥植物的根、莖、葉、種子和果實(shí)中［11］。目前已有研究［11-12］證實(shí)：β-谷甾醇在人體內(nèi)發(fā)揮多種有益作用，包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和抗衰老等作用。研究［13-14］表明：β-谷甾醇與HT22 海馬細(xì)胞膜結(jié)合，通過(guò)影響雌激素受體使磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）在膜脂募集，從而激活PI3K 信號(hào)通路，延緩因腦膜脂質(zhì)過(guò)氧化而加快的AD 進(jìn)展。β-谷甾醇還可通過(guò)與線粒體膜結(jié)合，提高增強(qiáng)線粒體內(nèi)膜流動(dòng)性腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）含量，延緩神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展［15］。

本研究對(duì)C57BL/6J 小鼠側(cè)腦室注射β 淀粉樣蛋白1-42（amyloid β-protein1-42，Aβ1-42）建立AD 模型，探討β-谷甾醇通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥對(duì)AD 模型小鼠認(rèn)知功能的改善作用，并闡明其可能的分子機(jī)制，為延緩AD 進(jìn)展，優(yōu)化神經(jīng)退行性疾病治療方案提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器72 只6～8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠（SPF 級(jí)）購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2011-0004。所有小鼠在光照/黑暗：12 h/12 h 環(huán)境中飼養(yǎng)，可自由飲食。β-谷甾醇（上海源葉生物科技有限公司），鹽酸多奈哌齊片（中國(guó)衛(wèi)才藥業(yè)有限公司），Aβ1-42（上海Sigma Aldrich 貿(mào)易有限公司），小鼠 IL-17A 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平測(cè)定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），重組Anti-p53 抗體、重組Anti-B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、重組Anti-β-actin抗體、重組Anti-Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、Anti-cleaved Caspase-3 抗體、Anti-Caspase-3 抗體和重組Anti-IL-17A 抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）。小鼠自由活動(dòng)箱、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)裝置和Morris 水迷宮（北京諾達(dá)思信息技術(shù)有限責(zé)任公司），核酸定量?jī)xNanoDrop 2000c、酶標(biāo)儀Multiskan GO 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司），垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），化學(xué)發(fā)光成像儀（Fusion FX7，法國(guó)Vilber 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模和給藥72 只C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、AD 組、鹽酸多奈哌齊組（0.6 mg·kg－1鹽酸多奈哌齊）、低劑量β-谷甾醇組（1.0 mg·kg－1β-谷甾醇）和高劑量β-谷甾醇組（4.0 mg·kg－1β-谷甾醇），每組12 只。除對(duì)照組和假手術(shù)組，其他各組小鼠按照參考文獻(xiàn)［16］的方法制備小鼠AD 模型，Aβ1-42在37 ℃無(wú)菌生理鹽水中孵育7 d，使蛋白肽結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而產(chǎn)生毒性。采用1.25% 阿佛丁溶液 （0.02 mL·g－1）對(duì)小鼠進(jìn)行深度麻醉，采用微針向小鼠側(cè)腦室注射5 μL Aβ1-42（1 g·L－1）建立AD 小鼠模型。假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室注射5 μL 生理鹽水，對(duì)照組小鼠不予處理。鹽酸多奈哌齊組、低劑量β-谷甾醇組和高劑量β-谷甾醇組小鼠自造模后灌胃β-谷甾醇或鹽酸多奈哌齊，連續(xù)給藥14 d，每日1 次。Aβ1-42注射造模7 d 后開(kāi)始行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)。待行為學(xué)實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，處死各組小鼠，取海馬組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠自由活動(dòng)次數(shù)小鼠自由活動(dòng)箱尺寸為（長(zhǎng)×寬×高=0.30m×0.30 m×0.45 m），箱體底部和側(cè)壁不透光，頂端設(shè)有紅外攝像機(jī)。將小鼠放入箱中試驗(yàn)開(kāi)始，小鼠自由活動(dòng)10 min 后開(kāi)始記錄，采集30 min 內(nèi)各組小鼠自由活動(dòng)次數(shù)。以自由活動(dòng)次數(shù)代表小鼠自主活動(dòng)能力。

1.4 筑巢行為實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠社會(huì)行為和日?；顒?dòng)能力筑巢行為實(shí)驗(yàn)區(qū)別于空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的行為實(shí)驗(yàn)，注重考察小鼠認(rèn)知功能，其更關(guān)注小鼠日?；顒?dòng)和執(zhí)行功能［17］。將群養(yǎng)的小鼠分成單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)48 h，每籠中換入厚度為1 cm 的玉米芯墊料，12 h 后放入方形無(wú)味薄紙片16 張（邊長(zhǎng)4 cm），18 h 后按照4 分法對(duì)筑巢質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分：1 分，紙片無(wú)規(guī)則地分散在籠子中，未被撕咬；2 分，紙片較松散地聚集于籠子一側(cè)，但無(wú)成型的巢，無(wú)明顯的撕咬痕跡；3 分，紙片聚攏折疊成型，但只有較平的巢，無(wú)明顯的撕咬痕跡；4 分，紙片聚攏折疊成較深的巢，并被撕咬成小塊。

1.5 新物體辨別實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠非空間記憶能力新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是一種較為精細(xì)的行為學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)記錄小鼠對(duì)不同物體探索時(shí)間的區(qū)別，檢測(cè)小鼠的非空間記憶能力［18］。按照參考文獻(xiàn)［19］的方法操作，實(shí)驗(yàn)在隔音和避光的裝置中進(jìn)行，固定尺寸（長(zhǎng)×寬×高=0.25 m×0.25 m×0.40 m），準(zhǔn)備3 個(gè)足夠重物體，其中2 個(gè)物體為顏色形狀完全一致的立方體，另一個(gè)物體為與前2 個(gè)物體完全不同的圓錐體。在測(cè)試裝置上方以60 W白光燈照射以消除陰影。適應(yīng)階段（第1 天）：僅將小鼠置入測(cè)試盒的中央，適應(yīng)活動(dòng)5 min；訓(xùn)練階段（第2 天）：在測(cè)試盒內(nèi)置入2 個(gè)顏色形狀完全相同的物體，位置固定，將小鼠背對(duì)物體置入裝置中，探索10 min；檢測(cè)階段（第3 天）：取出相同物體中的1 個(gè)物體，并于相同位置置入顏色外觀不同的物體，將小鼠背對(duì)物體置入裝置中，探索10 min。記錄不同階段小鼠探索時(shí)長(zhǎng)，并計(jì)算新舊物體辨別時(shí)間的比值，即辨別比（discrimination ratio，DR），以對(duì)新物體辨別時(shí)間和DR 代表小鼠非空間記憶能力。DR=探索新物體時(shí)間/探索物體總時(shí)間。

1.6 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠空間記憶和空間辨別能力實(shí)驗(yàn)前在水池壁上做不同標(biāo)記參照物，位置保持不變。定位巡航：水池十字均分為4 個(gè)象限，平臺(tái)始終置于第1 象限的中央不變。將小鼠頭朝池壁放入任一象限的水中，逃避潛伏期定義為小鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間。引導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)上臺(tái)并停留10 s。每次學(xué)習(xí)上限90 s，若小鼠未成功登陸平臺(tái)，記為90 s，每只小鼠每天間歇性訓(xùn)練3 次，連續(xù)訓(xùn)練5 d?？臻g探索：第7 天，移除平臺(tái)，開(kāi)始空間探索。將小鼠由第3 象限置入水中，記錄逃避潛伏期和90 s 內(nèi)小鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)用于評(píng)價(jià)小鼠的空間記憶和空間辨別能力。

1.7 RT-qPCR 法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達(dá)水平采用TRIzol 法提取小鼠海馬組織中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用2－ΔΔCt法計(jì)算各組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 Western blottig 法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中IL-17A、p53、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平采用勻質(zhì)儀破碎各組小鼠海馬組織總蛋白，溶解于含1%蛋白酶抑制劑PSMF 和2%磷酸酶抑制劑的RIPA 溶液中。采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，加入5×Loading Buffer 煮樣后離心。采用4%～20% 預(yù)制SDS-PAGE 分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。采用5% 脫脂奶粉封閉2 h，采用一抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)┓跤^(guò)夜，TBST 緩沖液洗滌后，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠二抗（1∶5 000 稀釋?zhuān)┓跤? h。采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像儀上成像目的蛋白條帶。以β-actin 為內(nèi)參，采用SHST 圖像分析軟件（杭州申花科技有限公司）檢測(cè)蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9 ELISA 法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH、TNF-α 及IL-17A 水平按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH、TNF-α 及IL-17A 水平。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 和412 nm 處吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和A 值計(jì)算海馬組織中SOD 活性和GSH、TNF- α 及IL-17A 水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，筑巢行為評(píng)分，對(duì)新物體辨別時(shí)間，DR，逃避潛伏期，跨越平臺(tái)次數(shù)，海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，海馬組織中Caspase 3、cleaved Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，SOD 活性和GSH、TNF-α 及IL-17A 水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠自主活動(dòng)能力和筑巢行為評(píng)分各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，AD 組小鼠筑巢行為評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和低劑量β-谷甾醇組小鼠筑巢行為評(píng)分升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)和筑巢行為評(píng)分Tab.2 Number of autonomic activity and scores of nesting behavior of mice in various groups (n=12，±s）

表2 各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)和筑巢行為評(píng)分Tab.2 Number of autonomic activity and scores of nesting behavior of mice in various groups (n=12，±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.05 vs AD group.

Group Score of nesting behavior Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol Number of autonomic activity 110.33±10.24 107.50±15.10 110.50±14.49 109.83±13.81 107.17±14.41 103.00±14.86 3.17±0.58 3.00±0.74 1.67±0.78*2.75±0.87△2.67±0.89△2.25±1.06

2.2 各組小鼠非空間記憶能力與對(duì)照組比較，AD 組小鼠對(duì)新物體辨別時(shí)間明顯減少（P＜0.01），且DR 明顯降低（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和高劑量β-谷甾醇組小鼠對(duì)新物體辨別時(shí)間明顯增加（P＜0.01），DR 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低劑量β-谷甾醇組小鼠對(duì)新物體辨別時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DR 升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠對(duì)新物體辨別時(shí)間和DRTab.3 Indentification time of new object and DR of mice in various groups(n=12，±s）

表3 各組小鼠對(duì)新物體辨別時(shí)間和DRTab.3 Indentification time of new object and DR of mice in various groups(n=12，±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs AD group.

Group DR Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol Idenfification time of new object (t/s)57.56±11.78 54.30±10.96 34.47±7.94*50.88±11.30△△39.37±10.68 44.53±4.01△△0.65±0.14 0.64±0.15 0.36±0.11*0.48±0.15 0.51±0.14△0.45±0.10

2.3 各組小鼠空間記憶和空間辨別能力隨著小鼠訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)增加，各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短，其中對(duì)照組小鼠逃避潛伏期縮短幅度較大，鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠逃避潛伏期也呈縮短趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，AD 組小鼠在定位巡航訓(xùn)練第3 和5 天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠訓(xùn)練第1 天逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠訓(xùn)練第3和5天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05或P＜0.01）。與對(duì)照組比較，AD組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)Tab.4 Escape latencies and number of crossing platform of mice in various groups(±s）

表4 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)Tab.4 Escape latencies and number of crossing platform of mice in various groups(±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs AD group.

Group n Escape latency(t/s)3 5 Number of crossing platform Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol 12 12 11 12 12 12(t/d) 1 80.73±5.10 81.36±4.51 81.33±4.93 80.23±3.75 77.10±5.95 80.19±4.96 47.47±12.57 54.06±13.00 75.14±8.35*62.12±11.56△61.91±9.87△56.57±10.40△△35.81±11.81 41.14±7.79 67.80±5.60*47.81±7.65△△52.79±12.06△△55.62±7.39△△2.70±0.65 2.80±0.97 5.90±1.60*3.10±1.30△△3.40±1.80△△4.00±1.21△△

2.4 各組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，AD 組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）。與AD 組比較，低和高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；鹽酸多奈哌齊組和高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中p53 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠海馬組織中IL-17A(A)和p53(B) mRNA 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of IL-17A(A) and p53 (B) mRNA in hippocampus tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠海馬組織中IL-17A、p53、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，AD 組小鼠海馬組織中IL-17A、p53 和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比值明顯升高（P＜0.01）。與AD 組比較，低劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比值明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），鹽酸多奈哌齊組小鼠海馬組織中cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A、cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2 比值明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A-C)和直條圖（D-H）Fig.2 Electrophoregrams(A-C) and histograms(D-F) of expressions of apoptosis-related proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平與對(duì)照組比較，AD 組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平明顯降低（P＜0.01）。與AD 組比較，高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平明顯升高（P＜0.01），鹽酸多奈哌齊組和低劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平Tab.5 SOD activities and GSH levels in hippocampus tissue of mice in various groups(n=3,±s）

表5 各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平Tab.5 SOD activities and GSH levels in hippocampus tissue of mice in various groups(n=3,±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.01 vs AD group.

Group Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol SOD[λB/(U·mL－1)]56.97±5.51 54.77±6.30 37.41±9.94*44.18±14.76 40.15±7.89 53.56±8.13△GSH[cB/(μmol·L－1)]123.47±27.99 123.71±22.85 70.59±9.64*88.30±10.95 93.70±16.22 109.59±13.59△

2.7 各組小鼠海馬組織中TNF-α 和IL-17A 水平

與對(duì)照組比較，AD 組小鼠海馬組織中TNF-α和IL-17A 水平明顯升高（P＜0.01）。與AD 組比較，低劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中TNF-α 水平降低（P＜0.05），高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A 水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠海馬組織中TNF-α 和IL-17A 水平Tab.6 Levels of TNF-α and IL-17A in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3,±s，ρB/(ng·L－1)]

表6 各組小鼠海馬組織中TNF-α 和IL-17A 水平Tab.6 Levels of TNF-α and IL-17A in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3,±s，ρB/(ng·L－1)]

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs AD group.

Group Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol IL-17A 192.98±57.22 218.30±62.85 489.49±45.26*454.13±92.60 415.89±64.78 381.97±94.82△TNF-α 467.63±36.50 495.21±54.06 571.12±52.05*547.58±32.65 507.49±41.57△525.28±39.31

3 討 論

本研究采用小鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42建立小鼠AD模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠海馬組織中IL-17A 蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在海馬組織中高表達(dá)，證實(shí)AD 小鼠海馬周?chē)M織神經(jīng)炎癥。使用β-谷甾醇治療后，小鼠海馬組織中IL-17A 蛋白表達(dá)水平降低。CHEN 等［20］研究顯示：IL-17 水平升高與AD 疾病的進(jìn)展有關(guān)。CRISTIANO 等［21］研究表明：采用IL-17 中和抗體治療減輕了AD 小鼠的神經(jīng)炎癥和記憶障礙，并提出了通過(guò)中和IL-17 可能成為未來(lái)治療AD 潛在途徑。因此，靶向IL-17 可能是治療AD 的潛在途徑，本研究為靶向IL-17 治療AD 提供了理論基礎(chǔ)。

本研究中AD 小鼠海馬組織中p53 蛋白表達(dá)水平升高，Bax/Bcl-2 比值和cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高。β-谷甾醇治療后，Bax/Bcl-2 比值降低，提示β-谷甾醇對(duì)于p53 信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是通過(guò)調(diào)控Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行的。AD 是一種以蛋白質(zhì)聚集物為特征的神經(jīng)退行性疾病，p53 聚集后激活，以應(yīng)對(duì)威脅基因組穩(wěn)定性的各種壓力源［22-23］。研究［24-25］表明：只有在AD 的早期階段，p53 蛋白才能在DNA 修復(fù)中發(fā)揮其功能。AD 大鼠腦組織中p53 蛋白表達(dá)水平升高，并維持持續(xù)的tau 蛋白過(guò)度磷酸化，而細(xì)胞中Aβ 蓄積有助于促進(jìn)下游p53 效應(yīng)［22，26］。激活的p53 誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯等功能，而DNA 修復(fù)機(jī)制的失敗導(dǎo)致p53 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［27］。

氧化應(yīng)激在AD 進(jìn)程中的作用十分重要。本研究結(jié)果顯示：AD 組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平降低，提示中樞系統(tǒng)的過(guò)度氧化應(yīng)激。而高劑量β-谷甾醇治療后，GSH 水平明顯升高。自由基可以促進(jìn)Aβ 蓄積，造成tau 蛋白過(guò)度磷酸化，使神經(jīng)元發(fā)生基因突變。當(dāng)機(jī)體無(wú)法維持自由基與清除自由基的平衡時(shí)，積聚的過(guò)氧化物與組織和細(xì)胞中的脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等過(guò)度反應(yīng)，造成組織損傷和細(xì)胞凋亡［28］。

綜上所述，本研究采用小鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42建立AD 模型，采用β-谷甾醇進(jìn)行干預(yù)治療，以多種行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)評(píng)估β-谷甾醇對(duì)AD 小鼠認(rèn)知功能的改善作用，并采用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)到小鼠海馬組織中IL-17 和p53 表達(dá)水平的改變，提示β-谷甾醇可能通過(guò)IL-17-p53 信號(hào)通路作用機(jī)制來(lái)抑制神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，改善AD 小鼠的認(rèn)知功能。