李 暢, 馬梓珊, 黃汕梅, 銀幫巧, 陳枝凡, 聶 莎, 張子謙, 李 力, 劉 鷹, 唐耀平,4

（1.廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院心血管內科，廣西南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心；廣西 南寧 530200；4.廣西壯族自治區(qū)高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉化醫(yī)學重點實驗室，廣西 南寧 530200）

冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）是目前嚴重危害人類健康的常見慢性疾病，急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是CAD的主要類型和致死病因［1-2］。研究［3］表明：一氧化氮（nitric oxide，NO）生物活性降低是導致內皮功能不平衡的關鍵原因，與線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）互相影響，在CAD 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3-4］。早在東漢時期，《金匱要略》［5-8］記載薏苡附子散治療“胸痹緩急”，即冠心病心絞痛，療效顯著。臨床上符合此方證者，無論是心臟神經官能癥、心絞痛、AMI或心律失常等均可采用薏苡附子散治療。薏苡附子散參與細胞周期、細胞凋亡和炎癥刺激等生物過程，具有強心鎮(zhèn)痛、抗炎和調節(jié)內分泌等藥理作用［9］。但薏苡附子散在心肌缺血中的作用機制尚未完全闡明。本研究觀察薏苡附子散對AMI 模型小鼠體內NO 生物活性和心肌組織的影響及其對小鼠離體主動脈舒張作用和人冠脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）中NO生物活性及內皮細胞線粒體功能的影響，探討薏苡附子散改善受損的血管內皮功能，保護心肌缺血的作用機制，為薏苡附子散的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器SPF 級C57BL/6J 小鼠100 只，8 周齡，雄性。購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司 ，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，本研究所有動物實驗操作均獲得廣西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號：DW20211109-175）。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學動物中心，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001，SPF 級環(huán)境（溫度25 ℃±1 ℃，濕度55%±5%，12 h∶12 h 光/暗循環(huán)），并嚴格按照3R 原則進行實驗。HCAECs 購自美國ATCC 公司。薏苡附子散由薏苡仁和黑順片2 種中藥組成，采用江陰天江藥業(yè)生產的薏苡仁顆粒劑和黑順片顆粒劑，由廣西中醫(yī)藥大學鑒定為正品。氧氣（廣西瑞達化工科技有限公司），異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），單克隆抗體β-肌動蛋白（β-actin）（上海生工生物工程有限公司），單克隆抗體內皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）蛋白（美國Cell Signaling 公司），N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME）、總NO 檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDSPAGE 凝膠快速配制試劑盒、彩色預染蛋白質相對分子質量標準、超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液和QuickBlockTMWestern 封閉液（上海碧云天生物科技有限公司），TMRM 和MitoSOXTMRed 試劑（美國賽默飛世爾科技公司），重酒石酸去甲腎上腺素（武漢遠大醫(yī)藥有限公司），4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京蘭杰柯科 技 有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（北京索萊寶科技有限公司）。Tecan Infinite 200Pro 酶標儀（上海迪奧生物科技有限公司），三氣培養(yǎng)箱、HM-325E 病理組織切片機和全自動組織脫水機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），BX54MRF-S 光學顯微鏡（日本 Olympus Corporation 公司），DMT620M四通道離體微血管張力測定系統(tǒng)（上海佰曄生物科技中心），557040 型號小動物呼吸機、Table Top 小動物麻醉機、Germinator 500 干式消毒器和小鼠心梗手術器械等（美國Harvard Bioscience公司），全能型成像分析系統(tǒng)、1658033型號電泳和蛋白免疫印跡系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）。

1.2 薏苡附子散制備薏苡附子散按《金匱要略》中原方配伍薏苡仁∶黑順片=1∶1，成人用量3 g·d－1。本研究依據普通成人（體質量70 kg）的臨床用量和動物與人之間的等效劑量換算公式將顆粒劑制成低、中和高劑量（0.2 g·mL－1、0.4 g·mL－1和0.8 g·mL－1）藥液，中劑量薏苡附子散由成人用量換算。將薏苡仁顆粒劑和黑順片顆粒劑以1∶1 的劑量溶解于超純水中，3 000 r·min－1離心5 min 后取上清液。

1.3 小鼠AMI 模型制備、分組和給藥60 只8 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為空白組、假手術組、AMI 組和低、中及高劑量薏苡附子散組，每組10 只。空白組小鼠按正常條件飼養(yǎng)，假手術組小鼠行開胸穿線不結扎冠狀動脈左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD），其余4 組小鼠采用于左心耳下緣1 mm 結扎LAD 的方法建立AMI 模型［10］，肉眼觀察小鼠心臟結扎處遠端心室壁由紅潤變蒼白，采用監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測并記錄各組小鼠心電圖，心電圖顯示ST 段抬高，判斷為造模成功［10］。除空白組外，其余各組小鼠給藥前30 min 均采用腹腔注射L-NAME 抑制小鼠體內eNOS 蛋白表達，劑量為20 mg·kg－1，Western blotting 法檢測小鼠心肌組織中eNOS 蛋白表達水平，eNOS 蛋白表達受抑制證明L-精氨酸-NO 通路阻滯［11］。低、中和高劑量薏苡附子散組小鼠分別給予不同濃度薏苡附子散藥液，其余各組小鼠給予生理鹽水，每只小鼠200 μL·d－1，灌胃給藥。AMI 模型小鼠建立成功當天為給藥第1 天，總給藥時間為28 d。

1.4 含藥血清制備、HCAECs培養(yǎng)和分組40只8 周齡的SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠隨機分為生理鹽水組和低、中及高劑量薏苡附子散組，每組10 只。各組分別取5 只小鼠，分別使用生理鹽水和低、中及高劑量薏苡附子散灌胃給藥干預小鼠28 d，每只小鼠200 μL·d－1。末次給藥1 h 后，經異氟烷氣體過量麻醉各組小鼠，采用眼眶取血法取各組小鼠血清，滅活除菌備用。

6 次傳代后，將HCAECs 以每孔2×105個細胞的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中。采用含10%胎牛血清DEME 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞分為空白組、缺氧組、缺氧+低劑量薏苡附子散組、缺氧+中劑量薏苡附子散組和缺氧+高劑量薏苡附子散組，每組設3 個復孔。除空白組外，其余各組HCAECs 于三氣培養(yǎng)箱中低氧條件下培養(yǎng) 24 h，建立細胞缺氧模型，并與100 μmol·L－1L-NAME 共同孵育。采用含10% 生理鹽水組小鼠血清的DEME 培養(yǎng)基干預空白組和缺氧組細胞，含10% 低、中和高劑量薏苡附子散組小鼠血清的DEME 培養(yǎng)基分別干預“1.3”步驟中培養(yǎng)缺氧+不同劑量薏苡附子散組細胞，空白組在正常條件下培養(yǎng)，其余各組繼續(xù)在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)24 h。

1.5 動脈張力檢測法檢測各組小鼠離體胸主動脈血管張力和舒張率采用多通道微血管張力測定儀檢測小鼠胸主動脈張力。各組分別取5只小鼠，根據TANG等［12］的方法剝離各組實驗小鼠內皮完整的胸主動脈，在含有各組小鼠胸主動脈的浴槽內加入終濃度為100 μmol·L－1L-NAME共同孵育20 min，并加入10－6mol·L－1去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）進行預收縮，待收縮穩(wěn)定后各組分別加入200 μL 生理鹽水和200 μL 低、中及高劑量薏苡附子散藥液進行干預，記錄各組小鼠胸主動脈張力值。待收縮平穩(wěn)后記錄為最大張力值，藥液干預后，胸主動脈張力趨于穩(wěn)定記錄為藥液張力值。舒張率= （胸主動脈收縮最大張力值－藥液張力值）/（胸主動脈收縮最大張力值－基礎平衡張力值）×100%。

1.6 總NO 檢測試劑盒檢測各組小鼠血清中NO水平每50 μL 樣本中加入室溫狀態(tài)Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ，37 ℃條件下反應30 min，于波長540 nm 處測定各組小鼠血清中吸光度（A）值。繪制標準品曲線計算各組小鼠血清中NO 水平，單位為μmol·L－1。

1.7 TTC 染色和HE 染色觀察各組小鼠心肌組織缺血面積和心肌組織病理形態(tài)表現各組隨機選取5 份小鼠心臟組織樣本，急凍后垂直于心臟長軸將其均勻切分為2～3 mm 切片，將切片浸入2% TTC溶液中。37 ℃中避光反應30 min，期間翻轉切片2 次使染色均勻。隨即取出切片，放入4%多聚甲醛中室溫固定過夜后第2 天取出觀察并拍照記錄。心肌組織缺血區(qū)域呈灰白色，正常組織呈紅色，計算各組小鼠心肌組織缺血面積百分率。心肌組織缺血面積百分率=心肌組織缺血面積/心臟切片面積×100%。

各組隨機選取5 份心臟組織樣本，浸入4%多聚甲醛通用型組織固定液中固定24 h。根據郭玉洪等［13］的方法將固定好的組織放入標記好的包埋框中于自動脫水機中脫水、透明和浸蠟。洗滌過的樣品被處理并包埋于石蠟中。切割為4 μm 厚的石蠟切片，HE 染色后置于顯微鏡下觀察并拍照記錄，觀察各組小鼠心肌組織病理形態(tài)表現。

1.8 觀察各組小鼠存活情況每天08：00、14：00 和20：00 對所有實驗小鼠進行3 次觀察，直至觀察到小鼠自然死亡或生存至28 d，記錄小鼠的一般情況及死亡情況。

1.9 Griess 實驗檢測各組HCAECs 中NO 水平

取“1.4”步驟中干預處理后的細胞，棄原培養(yǎng)基，對各組細胞進行裂解后取其上清液，采用Griess 反應測定細胞中NO 水平。每組100 μL 細胞上清樣品和100 μL Griess 試劑于室溫條件下反應30 min 后，采用酶標儀于波長540 nm 處測量各樣本A 值。根據NaNO2繪制標準曲線并計算各組細胞中NO 水平，單位為mmol·L－1。

1.10 熒光染色法檢測各組HCAECs 中MMP水平取“1.4”步驟中干預處理后的細胞，棄原培養(yǎng)基，采用PBS 緩沖液清洗后制備1×TMRM工作液，避光孵育各組細胞30 min，PBS 緩沖液清洗3 次后加入DAPI 染核常溫孵育10 min。采用倒置熒光生物顯微鏡于波長548 和474 nm 處進行觀察并拍照。TMRM 在正常細胞中產生紅色熒光，采用Image J 測量紅色熒光強度，以紅色熒光強度代表各組細胞中MMP 水平。

1.11 熒光染色法檢測各組HCAECs中ROS水平取“1.4”步驟中干預處理后的細胞，棄原培養(yǎng)基，采用PBS 緩沖液清洗后制備5 μmol·L－1MitoSOXTMRed 試劑工作液，避光孵育細胞10 min，PBS 緩沖液清洗3 次后DAPI 染核，采用倒置熒光生物顯微鏡于波長510 和480 nm 處進行觀察并拍照，ROS 在缺氧狀態(tài)的細胞線粒體中產生紅色熒光，采用Image J 測量紅色熒光強度，以紅色熒光強度代表各組細胞中ROS 水平。

1.12 統(tǒng)計學分析采用Graphpad 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠心肌組織中eNOS 蛋白表達水平、離體胸主動脈血管張力和舒張率、血清中NO 水平及心肌組織缺血面積百分率，各組HCAECs 中NO 水平、MMP 及ROS 水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，采用Graphpad 8.0.2 軟件繪制小鼠生存曲線，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AMI 模型小鼠心電圖各組小鼠在建立AMI模型前生命體征均正常，心電圖結果顯示為正常心電圖。建立AMI 模型后小鼠心電圖結果顯示：ST段較造模前明顯抬高。

2.2 各組小鼠心肌組織中eNOS 蛋白表達水平與空白組比較，注射L-NAME 后假手術組、AMI組和低、中及高劑量薏苡附子散組小鼠心肌組織中eNOS 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。eNOS 抑制劑L-NAME 抑制了體內依賴eNOS 蛋白生成NO 的經典途徑。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織中eNOS 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.1 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of eNOS protein in myocardium tissue of mice in various groups

2.3 各組小鼠離體胸主動脈血管張力和舒張率與生理鹽水組比較，低、中和高劑量薏苡附子散組小鼠胸主動脈血管舒張率升高（P＜0.05）。見圖2 和3。

圖2 各組小鼠胸主動脈血管張力Fig.2 Vascular tensions of thoracic aorta of mice in various groups

圖3 各組小鼠胸主動脈血管舒張率Fig.3 Relaxation rates of thoracic aorta of mice in various groups

2.4 各組小鼠血清中NO水平 與空白組和假手術組比較，AMI 組小鼠血清中NO 水平降低（P＜0.05），高劑量薏苡附子散組小鼠血清中NO 水平升高（P＜0.05），低和中劑量薏苡附子散組小鼠血清中NO 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與AMI 組比較，低、中和高劑量薏苡附子散組小鼠血清中NO 水平升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠血清中NO 水平Fig.4 Levels of NO in serum of mice in various groups

2.5 各組小鼠心肌組織缺血面積和心肌組織病理形態(tài)表現TTC 染色結果顯示：與空白組和假手術組比較，AMI 組和低、中及高劑量薏苡附子散組小鼠心肌組織均有不同程度的心肌缺血。與AMI 組比較，低、中和高劑量薏苡附子散組小鼠心肌組織缺血面積減少，心肌組織缺血面積百分率降低（P＜0.05）。見圖5 和6。HE 染色結果顯示：在光鏡下觀察，空白組和假手術組小鼠心肌細胞排列整齊，胞核清晰完整，大小均勻，未見炎性細胞浸潤；AMI 組具有明顯的心肌組織損傷，心肌細胞排列紊亂、破裂壞死，有炎性細胞浸潤；低、中和高劑量薏苡附子散組可見心肌組織病理性損傷恢復。見圖7。

圖5 TTC 染色觀察各組小鼠心肌組織缺血面積Fig.5 Ischemia areas of myocardium tissue of mice in various groups detected by TTC staining

圖6 各組小鼠心肌組織缺血面積百分率Fig.6 Percentage of ischemia areas of myocardium tissue of mice in various groups

圖7 各組小鼠心肌組織病理形態(tài)表現(HE,×300)Fig.7 Pathomorphology of myocardium tissue of mice in various groups(HE,×300)

2.6 各組小鼠術后生存率藥物干預第28 天，空白組和假手術組小鼠生存率為100%。與AMI 組比較，低、中和高劑量薏苡附子散組小鼠生存率升高（χ2=15.03，P=0.010 2）。見圖8。

圖8 各組小鼠術后生存率Fig.8 Survival rates of mice in various groups after operation

2.7 各組HCAECs 中NO 水平與空白組比較，缺氧組和缺氧+低劑量薏苡附子散組HEAECs 中NO 水平降低（P＜0.05），缺氧+中劑量薏苡附子散組和缺氧+高劑量薏苡附子散組HEAECs 中NO水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與缺氧組比較，缺氧+中劑量薏苡附子散組和缺氧+高劑量薏苡附子散組HCAECs 中NO 水平升高（P＜0.05）。見圖9。

2.8 各組HCAECs 中MMP 水平與空白組比較，缺氧組、缺氧+低劑量薏苡附子散組和缺氧+中劑量薏苡附子散組HCAECs 中MMP 水平降低（P＜0.05）。與缺氧組比較，缺氧+中劑量薏苡附子散組和缺氧+高劑量薏苡附子散組HCAECs 中MMP水平升高（P＜0.05）。見圖10。

圖10 各組HCAECs 中 MMP 水平Fig.10 Levels of MMP in HCAECs in various groups

2.9 各組HCAECs 中ROS 水平與空白組比較，缺氧組、缺氧+低劑量薏苡附子散組和缺氧+中劑量薏苡附子散組HCAECs 中ROS 水平升高（P＜0.05）。與缺氧組比較，缺氧+低劑量薏苡附子散組、缺氧+中劑量薏苡附子散組和缺氧+高劑量薏苡附子散組HCAECs 中ROS 水平降低（P＜0.05）。見圖11。

圖11 各組HCAECs 中ROS 水平Fig.11 Levels of ROS in HCAECs in various groups

3 討 論

薏苡附子散藥方出自于東漢《金匱要略》［14］，由薏苡仁和附子2 味藥物組成。薏苡仁具有抗氧化、降血壓和調節(jié)糖脂代謝等藥理作用。附子為“回陽救逆”第一要藥，具有清除ROS、抑制心肌細胞凋亡、強心鎮(zhèn)痛及舒張血管的藥理作用，其舒張血管的作用可能與血管內皮釋放NO 有關聯［15］。本研究結果顯示：薏苡附子散減少了小鼠心肌組織缺血面積，改善小鼠心肌組織損傷，提高小鼠心肌組織缺血后的存活率，可以有效改善小鼠心肌缺血；薏苡附子散可以明顯舒張小鼠離體胸主動脈，提示其可以通過舒張血管發(fā)揮其治療心肌缺血的作用。

內皮功能正常是維持血管穩(wěn)態(tài)的重要因素，通過釋放NO 和血管緊張素Ⅱ等旁分泌因子參與維持血管穩(wěn)態(tài)［18］。氧化應激導致血管內皮功能障礙，NO 生物利用度下降，引起血管收縮和促血栓形成等不良心血管反應，缺血時會產生大量ROS，引起內皮細胞氧化應激損傷，導致內皮功能失衡［18-19］。線粒體是細胞中產生ROS 的主要細胞器，也是缺血性損傷的主要靶點，MMP 水平降低導致線粒體三磷酸腺苷合成減少，線粒體功能障礙在內皮功能障礙引起的缺血性心血管疾病中也同樣起決定性作用［20-22］。研究［22-23］顯示：氧化應激失調促進細胞中線粒體凋亡，改善氧化應激狀態(tài)，維持MMP 水平，減少ROS生成，上調NO水平，可以有效地改善血管內皮功能，治療缺血性心血管疾病。

研究［9，24］發(fā)現：薏苡附子散的主要成分作用于代謝酶-神經酰胺，參與細胞周期、細胞凋亡、抗炎及調節(jié)細胞氧化應激，從而發(fā)揮治療心血管疾病的作用。CAD 心肌缺血患者心肌組織處于缺血缺氧狀態(tài)，在缺氧條件下，體內依賴eNOS 蛋白生成NO 的經典途徑L-精氨酸-NO 途徑受到抑制［16-17］。本研究結果顯示：薏苡附子散升高AMI模型小鼠心肌組織和缺氧HEAECs 中NO 水平，升高HEAECs 中MMP 水平并抑制了ROS 的生成，表明薏苡附子散可以上調NO 水平，改善線粒體功能，調節(jié)氧化應激，改善血管內皮功能障礙，這是薏苡附子散治療心肌缺血的作用機制之一。

綜上所述，薏苡附子散可以上調心肌組織中NO 水平，舒張血管，恢復MMP，改善線粒體功能障礙，調節(jié)氧化應激，抑制ROS 的生成，改善血管內皮功能障礙，從而發(fā)揮治療心肌缺血的作用。