章天珍, 沈洪濤, 龔 正, 趙 斌, 王 巖

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所 廣東省衰老相關(guān)心腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 湛江 524001）

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）激酶5（GPCR kinases 5，GRK5）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，調(diào)節(jié)GPCR 的磷酸化和脫敏［1-2］。GRK5 與微管蛋白和α-突觸核蛋白等非GPCR 底物磷酸化有關(guān)聯(lián)［3-4］。GRK5 可參與多種疾病進(jìn)展，如社交障礙、成癮行為、精神分裂癥和帕金森病等，也參與心血管疾病及癌癥等疾病過程［5-12］。研究［13］顯示：GRK5 與抑郁有關(guān)，參與抑郁的進(jìn)展。Tau 蛋白改變不僅是阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的主要病理表現(xiàn)之一，亦與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)［14］。研究［15］顯示：Tau 蛋白沉積很可能是重度抑郁癥的基礎(chǔ)。P301S Tau 轉(zhuǎn)基因小鼠以朊病毒蛋白啟動(dòng)子（prion protein promoter，Prnp）插入P301S 突變基因，表達(dá)人源Tau 蛋白，其表達(dá)量約為小鼠內(nèi)源性Tau 蛋白表達(dá)量的5 倍。6 月齡P301S 小鼠可表現(xiàn)出空間認(rèn)知障礙、后肢癱瘓和精神異常等行為學(xué)表現(xiàn)，病理上出現(xiàn)Tau 蛋白過度磷酸化、膠質(zhì)細(xì)胞激活和突觸損傷等［16-18］。研究［13］證實(shí)：Tau 增強(qiáng)N-甲基-D- 天冬氨酸受體 （N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）依賴性去電位，NMDAR 是興奮性谷氨酸鹽神經(jīng)遞質(zhì)的受體，在腦內(nèi)廣泛分布，與神經(jīng)元突觸傳遞、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶、疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等密切相關(guān)。當(dāng)NMDAR 功能低下時(shí)，其與重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）的發(fā)病過程有關(guān)，表明攜帶P301S 突變基因的Tau 小鼠可能與抑郁表現(xiàn)有關(guān)，GRK5 對P301S Tau 轉(zhuǎn)基因小鼠抑郁樣行為的影響尚未完全闡明。本研究采用腦立體定位儀向小鼠海馬區(qū)中注射GRK5 過表達(dá)病毒，探討GRK5 對P301S Tau 轉(zhuǎn)基因小鼠抑郁樣行為的影響，進(jìn)一步闡明其病理過程及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、病毒、主要試劑和儀器3 月齡P301S Tau 轉(zhuǎn)基因小鼠購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2020-0009。飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃、相對濕度（60±5）%、12 h 光照/12 h 黑暗周期環(huán)境中，自由進(jìn)食。GRK5 過表達(dá)腺相關(guān)病毒購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。BCA 試劑盒購自美國Novagen 公司，Western blotting 抗體稀釋液和免疫熒光抗體稀釋液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。腦立體定位注射儀購自德國Neurostar 公司，OLYMPUS FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus 公司，懸尾儀和強(qiáng)迫游泳儀購自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。

1.2 動(dòng)物分組和處理P301S Tau 轉(zhuǎn)基因小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，小鼠5 月齡時(shí)，采用5%水合氯醛麻醉 （0.9 mL·100 g－1），脫毛暴露頭部皮膚，將小鼠固定于腦立體定位儀，剪開頭皮暴露前后囟門，將前囟設(shè)為0 點(diǎn)，根據(jù)小鼠腦圖譜設(shè)置注射參數(shù)，前后：－2.3 mm，左右：±2.0 mm，背腹：－1.8 mm。根據(jù)上述參數(shù)在顱骨相應(yīng)位置鉆孔。采用微量進(jìn)樣器給予小鼠每側(cè)海馬區(qū)1.5 μL病毒，注射速度0.1 μL·min－1。每次注射結(jié)束后，針頭停留5 min。結(jié)束后，縫合傷口，將小鼠安放于溫暖環(huán)境。17 只雄性P301S Tau 小鼠隨機(jī)分為空白對照組（n=6，不進(jìn)行任何處理）、陰性對照組（n=5，雙側(cè)海馬區(qū)注射GRK5 陰性對照腺相關(guān)病毒）和過表達(dá)組（n=6，雙側(cè)海馬區(qū)注射GRK5 腺相關(guān)病毒并插入目的基因空載體AAV-GRK5-EGFP-3FLAG）。

1.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠糖水偏好率實(shí)驗(yàn)開始前訓(xùn)練小鼠適應(yīng)含糖飲水：每籠同時(shí)放置2 個(gè)水瓶，第一個(gè)24 h 內(nèi)給予2 瓶1%蔗糖水；隨后的24 h 內(nèi)，給予1 瓶1 %蔗糖水和1 瓶純水。實(shí)驗(yàn)開始后，首先禁食禁水24 h，再給予1 瓶1 %蔗糖水和1 瓶純水，實(shí)驗(yàn)期間每6 h 更換水瓶位置，24 h 后，取2 瓶水稱質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠糖水偏好率。小鼠糖水偏好率＝糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.4 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）檢測各組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率將小鼠尾部距末端約2 cm 處采用膠帶固定，倒懸于30 cm× 25 cm×25 cm 箱內(nèi)的支架上，使小鼠頭部距箱底約5 cm。懸掛時(shí)間為6 min，統(tǒng)計(jì)后4 min 內(nèi)不動(dòng)時(shí)間，計(jì)算各組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率。不動(dòng)時(shí)間百分率=4 min 內(nèi)不動(dòng)時(shí)間（min）/240 min×100%。

1.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）檢測各組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率在直徑15 cm，高50 cm 透明玻璃圓缸內(nèi)，裝入30 cm 深的清水，水溫（23±2）℃，實(shí)驗(yàn)開始后將小鼠放入水中，測試持續(xù)時(shí)間為6 min，統(tǒng)計(jì)小鼠后4 min 內(nèi)不動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠從水中移出，擦干水放回籠中，計(jì)算各組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率。不動(dòng)時(shí)間百分率=4 min 內(nèi)不動(dòng)時(shí)間（min）/240 min×100%。

1.6 Western blotting 法檢測各組小鼠海馬組織中神經(jīng)功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平取各組小鼠半腦海馬組織，加入裂解液進(jìn)行研磨，4 ℃離心提取蛋白，采用BCA 法測定各樣品蛋白濃度。蛋白樣品加入Loading Buffer 后，100 ℃煮沸5 min，上樣量為30 μg。60 V 電壓電泳直至樣品到達(dá)分離膠，調(diào)節(jié)電壓至100 V 電泳直至溴酚藍(lán)在分離膠底部。200 V 恒壓轉(zhuǎn)膜2 h 后，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，GRK5（1∶200），小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物抗體（ionized calciumbiding adapter molecule 1，IBA1）（1∶500），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（1∶1 000），突觸小泡蛋白（synatotagmin，SYN）（1∶1 000），突觸后致密蛋白95（postsynaptic density 95，PSD95）（1∶1 000），神經(jīng)元特異性核蛋白（neuronspecific nuclear protein，NeuN）（1∶1 000），Tau T205（1∶1 000），β-actin（1∶1 000），TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min；室溫下孵育二抗羊抗鼠或羊抗兔（1∶10 000）1 h；TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min，ECL 發(fā)光液使條帶顯影。以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值／內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 免疫熒光染色檢測各組小鼠海馬組織中IBA1、NeuN 和GFAP 表達(dá)情況小鼠麻醉后，4%多聚甲醛灌注取腦組織，采用10%、20%和30%蔗糖梯度脫水，OCT 包埋劑包埋腦組織，存放于－80℃環(huán)境中。采用冰凍切片機(jī)切10 μm 薄片，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，通透液作用10 min，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，10%山羊血清室溫下封閉30 min，孵育一抗IBA1（1∶200），GFAP（1∶200），NeuN（1∶500），4 ℃過夜，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，室溫孵育熒光二抗1 h，DAPI染色3 min。采用OLYMPUS FV3000 共聚焦顯微鏡拍攝熒光圖像并記錄各組小鼠海馬組織中IBA1、NeuN 和GFAP 表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠糖水偏好率、不動(dòng)時(shí)間百分率、海馬組織中神經(jīng)功能相關(guān)蛋白GRK5、IBA1、GFAP、SYN、PSD95、NeuN 和 Tau T205 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Tukey 事后檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠糖水偏好率和不動(dòng)時(shí)間百分率糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組小鼠糖水偏好率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)組小鼠糖水偏好率升高（P＜0.05）。TST 和FST檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠糖水偏好率和不動(dòng)時(shí)間百分率Tab.1 Sugar-water perference rate and percentages of immobility time of mice in various groups (±s，η/%）

表1 各組小鼠糖水偏好率和不動(dòng)時(shí)間百分率Tab.1 Sugar-water perference rate and percentages of immobility time of mice in various groups (±s，η/%）

*P＜0.05 compared with blank control group；ΔP＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control Over-expression Percentage of immobility time in TST 14.70±13.46 12.64±6.07 44.03±16.17*Δ n655 Sugar-water perference rate 43.40±19.88 38.56±13.21 78.65±5.47*Δ Percentage of immobility time in FST 13.65±11.77 15.46±3.85 46.46±16.83*Δ

2.2 各組小鼠海馬組織中神經(jīng)功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)組小鼠海馬組織中GRK5、Tau T205 和IBA1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），SYN 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），GFAP、NeuN 和PSD95 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1 和表2。

圖1 各組小鼠海馬組織神經(jīng)功能相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of neurological funcion-related-proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

表2 各組小鼠海馬組織中GRK5、Tau T205、IBA1、GFAP、NeuN、PSD95 和SYN 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of GRK5, Tau T205, IBA1, GFAP, NeuN, PSD95, and SYN proteins in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3，±s，ρB/（g·L－1）］

表2 各組小鼠海馬組織中GRK5、Tau T205、IBA1、GFAP、NeuN、PSD95 和SYN 蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of GRK5, Tau T205, IBA1, GFAP, NeuN, PSD95, and SYN proteins in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3，±s，ρB/（g·L－1）］

*P＜0.05 compared with blank control group；ΔP＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control Over-expression SYN 1.05±0.07 1.05±0.08 0.74±0.10*Δ GRK5 0.98±0.02 1.25±0.30 2.56±0.14*Δ Tau T205 1.08±0.10 1.24±0.04 1.54±0.11*Δ IBA1 1.07±0.13 1.29±0.12 2.03±0.27*Δ GFAP 1.05±0.05 1.14±0.08 1.05±0.10 NeuN 0.85±0.22 0.69±0.09 0.57±0.13 PSD95 1.02±0.03 1.12±0.09 1.06±0.10

2.3 各組小鼠海馬組織中增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）表達(dá)免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組和過表達(dá)組小鼠海馬組織中均有EGFP 表達(dá)，表明病毒成功注射至海馬區(qū)。腦細(xì)胞中EGFP 主要與NeuN 發(fā)生共定位，而小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中幾乎未觀察到EGFP，表明EGFP 主要在神經(jīng)元細(xì)胞核中表達(dá)。與陰性對照組比較，過表達(dá)組小鼠海馬組織中EGFP 表達(dá)更集中于神經(jīng)元的細(xì)胞核中。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織中EGFP 和NeuN 表達(dá)（免疫熒光，×10）Fig.2 Expressions of EGFP and NeuN in hippocampus tissue of mice in various groups(Immunofluorescence,×10)

2.4 GRK5 過表達(dá)后各組小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)組小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明GRK5 主要影響小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。見圖3 和4。

圖3 各組小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)Fig.3 Number of microglia in hippocampus tissue of mice in various groups

圖4 各組小鼠海馬組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)Fig.4 Number of astrocytes in hippocampus tissue of mice in various groups

3 討 論

抑郁癥是目前常見的心理疾病，是以持久的情緒低落、思維遲緩、認(rèn)知功能損害、意志活動(dòng)減退和軀體癥狀為主要臨床特征的一類心境障礙［19］。其病因不清，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及基因遺傳、人格和環(huán)境等多種因素，目前研究的機(jī)制有炎癥反應(yīng)假說、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體假說、谷氨酸及其受體假說、下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸功能失調(diào)假說、神經(jīng)營養(yǎng)因子假說和多因素綜合等［20］。研究［13］顯示：GRK5 基因與抑郁篩查量表患者健康問卷（patient health questionnaire，PHQ）評分顯著相關(guān)，通過對具有社會(huì)經(jīng)濟(jì)特性的湯森德剝奪指數(shù)（townsend deprivation index，TDI）組成的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并以TDI 為環(huán)境因子進(jìn)行全基因組基因-環(huán)境相互作用研究，確定了GRK5 為抑郁的候選基因之一。研究［5］顯示：在曠場試驗(yàn)中，GRK5 缺陷小鼠在中心區(qū)的時(shí)間較其野生型同窩小鼠延長，但在TST 和FST 中表現(xiàn)正常，表明GRK5 缺陷小鼠可表現(xiàn)出焦慮樣行為。

本研究結(jié)果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，過表達(dá)組小鼠海馬組織中GRK5 和IBA1 蛋白表達(dá)水平升高；與空白對照組比較，陰性對照組和過表達(dá)組小鼠海馬組織均有EGFP 表達(dá)，表明在P301S Tau 小鼠海馬組織中實(shí)現(xiàn)了GRK5 的過表達(dá)，提示GRK5 過表達(dá)的小鼠模型構(gòu)建成功。

P301S Tau 小鼠GRK5 過表達(dá)后，在無壓迫環(huán)境中糖水偏好率升高，在TST 和FST 壓迫環(huán)境中小鼠不動(dòng)時(shí)間百分率升高，表現(xiàn)為抑郁樣行為。這種矛盾的行為學(xué)表現(xiàn)可能與環(huán)境有關(guān)，表明GRK5可能是抑郁的風(fēng)險(xiǎn)基因，這項(xiàng)結(jié)果與YE 等［13］研究結(jié)果一致，該風(fēng)險(xiǎn)基因GRK5 可以與環(huán)境等因素協(xié)同作用誘導(dǎo)抑郁樣行為的發(fā)生。

抑郁癥發(fā)病與海馬組織體積減小、神經(jīng)元衰亡和丟失及突觸和神經(jīng)發(fā)生減少等神經(jīng)可塑性改變有關(guān)［21］。SYN 缺失可能導(dǎo)致突觸間信息傳遞功能缺損，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元突觸可塑性受損，引發(fā)抑郁癥等多種認(rèn)知及情感相關(guān)精神障礙［22］。研究［15，23］顯示：Tau 蛋白積累與抑郁的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：GRK5 過表達(dá)后，P301S Tau 小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，Tau T205 蛋白表達(dá)水平升高，提示抑郁癥發(fā)病機(jī)制可能與海馬組織和Tau 蛋白有關(guān)聯(lián)。

GRK5 是一種多功能蛋白，在不同類型的細(xì)胞中均有表達(dá)，在不同的信號(hào)傳導(dǎo)過程中GRK5 在亞細(xì)胞器中表達(dá)存在差異。GRK5 可調(diào)節(jié)GPCR，也可與非GPCR 相關(guān)蛋白和DNA 自身相互作用［24］。心肌細(xì)胞在促肥大刺激條件下，GRK5 易位至細(xì)胞核，并且在核內(nèi)積累，促進(jìn)活化的T 細(xì)胞核內(nèi)因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）活性，從而介導(dǎo)核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［25］。GRK5 在神經(jīng)元中過表達(dá)可負(fù)性調(diào)控5-羥色胺受體介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路激活，以介導(dǎo)核內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)［9］。本研究結(jié)果顯示：過表達(dá)的GRK5 蛋白主要出現(xiàn)在神經(jīng)元核內(nèi)，表明GRK5 具有入核功能，提示模型小鼠抑郁樣行為表現(xiàn)可能與GRK5 在神經(jīng)元核內(nèi)積累有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，GRK5 過表達(dá)P301S Tau 小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞增生，SYN 和NeuN 蛋白表達(dá)減少等病理改變可能與GRK5 入核并在核中表達(dá)增加有關(guān)聯(lián)，從而誘導(dǎo)抑郁樣行為。