李小琴，張鳳良*，吳 裕，毛常麗，楊 湉，趙 祺

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪 666100；2.西雙版納云墾澳洲堅果科技開發(fā)有限公司，云南景洪 666100）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于高溫、高濕、靜風的亞馬遜河流域熱帶雨林［1］，適宜生長溫度為20～30℃。當溫度低于15℃時，橡膠樹生長基本停止；低于5℃時，會出現(xiàn)枝枯、莖枯、爆皮等寒害癥狀；低于0℃時，受寒嚴重，甚至死亡［2-4］。我國自上個世紀50 年代植膠以來，冬季寒潮低溫對橡膠樹的危害不時發(fā)生，1961 年起至今我國一直在開展橡膠樹抗寒高產(chǎn)選育種工作［5］。開展此項工作首先面對的問題是如何鑒定橡膠樹抗寒力，目前最常用的室內(nèi)抗寒鑒定方法為電導法，該方法具有應用廣泛、簡便、結果顯著等特點［6-11］。本研究選用橡膠樹對低溫傷害表現(xiàn)最直觀的樹皮組織作為材料，在同一低溫處理下設置不同處理時長，測定42 份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源樹皮組織在低溫脅迫后的相對電導率，結合樹皮厚度，對持續(xù)低溫下橡膠樹種質(zhì)的耐寒力進行鑒定評價，旨在短期內(nèi)篩選出耐寒力強的橡膠樹種質(zhì)資源，同時為加快橡膠樹抗寒性選育種、降低選育種成本提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用“農(nóng)業(yè)部景洪橡膠樹種質(zhì)資源圃”苗圃地內(nèi)42 份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源一年生嫁接無性系作為試驗材料。所有苗木均為2020 年采集芽條，以GT1 開放授粉實生苗為砧木芽接繁殖成無性系，并于2021 年4 月鋸干，按株行距0.6 m×0.8 m 育苗保留。苗圃地按照常規(guī)育苗管理，苗木生長良好。試驗于2022 年2 月下旬進行，每個無性系選取長勢基本一致的由頂部向下第三個葉蓬所在的枝條（生長狀態(tài)處于半木質(zhì)化）作為材料。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及低溫處理方法

每份橡膠樹種質(zhì)選取3 株長勢均勻且健康的植株進行采樣及編號，采集好的枝條隨即放到便攜式冷藏箱內(nèi)。帶回實驗室后先用洗潔精將枝條上的雜質(zhì)快速清洗干凈，再用雙蒸水沖洗干凈后吸干水分，隨即測定枝條韌皮部的相對電導率及樹皮厚度。

將所有取過樣的枝條放入設定溫度為-2℃的人工低溫培養(yǎng)箱內(nèi)，按照低溫處理時間設置5 個時間梯度：8 h、16 h、18 h、21 h 和24 h。為保證取樣的相對一致性，所有處理均用同一批枝條，每個處理設3 個重復，以未經(jīng)處理的作為對照。

1.2.2 相對電導率及樹皮厚度測定方法

相對電導率測定：取樣時注意避開枝條上的芽眼，用美工刀準確裁取0.5 cm×1.0 cm 的小方塊樹皮，同一時間處理的每個無性系共裁取6 個小片，一個試管中放入2 片，加入超純水20 mL，蓋上試管蓋后混合均勻，室溫放置24 h，期間注意搖勻數(shù)次。采用SG3-ELK 型便攜式電導率儀測出浸提液的初始電導值（E1），再蓋上試管蓋放入沸水浴，煮沸0.5 h 取出，冷卻至室溫測其終電導值（E2），同時測出雙蒸水的電導值（E0）。按以下計算公式計算出相對電導率：

相對電導率REC（%）=（E1－E0）/（E2－E0）×100%

樹皮厚度測量：從枝條中部裁取小塊樹皮，用游標卡尺測量樹皮厚度，重復3 次，測量時避開芽眼。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 對試驗數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合、相關性及聚類分析。按Logistic 方程Y=K/(1+ae-bt) 進行非線性回歸擬合，其中：Y為低溫處理下的橡膠樹組織相對電導率，t為處理時間，K、a、b 為參數(shù)，K 為Y的最大極限值。由擬合出的方程計算出當Y為50%時對應的時間t值，即為橡膠樹枝條樹皮組織半致死時間LT50。半致死時間越長，該樹種耐寒性越強。

2 結果與分析

2.1 相對電導率變化情況及耐寒性比較

所測42 份種質(zhì)相對電導率的變化情況詳見表1，-2℃低溫下，隨著低溫處理時間的延長，橡膠樹樹皮組織細胞的膜透性增大，電解質(zhì)滲透率隨之增加，相對電導率呈不同程度的“S”型上升趨勢。在8 h 時，相對電導率均值為32.79%，與對照相比，相對電導率值增加了6.08 個百分點，受寒害程度較??；16 h 時，已有6 份種質(zhì)（占總種質(zhì)14.28%）相對電導率超過50%，其中最大的已達到82.00%（64 號種質(zhì)），說明這6 份種質(zhì)的耐寒性表現(xiàn)最差；在18 h 時，相對電導率均值為49.89%，已接近50%，且21 h 時，有17 份種質(zhì)相對電導率超過50%，18～21 h 時間段為多數(shù)種質(zhì)的耐寒能力敏感期；在24 h 時，40 份種質(zhì)的相對電導率已超過50%，且均值已高達85.02%，表現(xiàn)出對此低溫時長的極不耐受，僅19 號（44.13%）和20 號（49.28%）種質(zhì)表現(xiàn)出較強的耐寒能力。

表1 42份橡膠樹種質(zhì)持續(xù)低溫處理下相對電導率變化、耐寒性及樹皮厚度比較

根據(jù)Logistic 方程Y=K/(1+ae-bt) 進行擬合，對橡膠樹枝條半致死時間（LT50）進行計算（表1）,42 份種質(zhì)的半致死時間變幅為9.34～30.49 h，變幅較大；Logistic 方程擬合度R2均值為0.800，擬合效果較好；半致死時間均值為17.76 h，半致死時間高于18 h 的種質(zhì)有15 份，此時間點進行耐寒性種質(zhì)篩選的入選率為35.71%；高于21 h 的有6 份種質(zhì)，占比為14.29%。

2.2 各指標間相關性分析

對42 份橡膠樹種質(zhì)資源的不同低溫處理時長下的相對電導率與半致死時間、樹皮厚度進行相關性分析（表2）可知：-2℃低溫下，持續(xù)處理16 h、18 h 及21 h 三個時間段的相對電導率值均互相呈極顯著（P＜0.01）正相關；半致死時間與5個不同處理時間段的相對電導率均呈極顯著負相關，相關系數(shù)最大的是21 h 的；由表1 可知，所測42 份種質(zhì)的樹皮厚度在0.47～0.92 mm，變幅較大，均值0.66 mm，樹皮厚度與半致死時間呈顯著（P＜0.05）正相關，說明樹皮越厚，可能半致死時間越長；而與處理24 h 的相對電導率值呈顯著負相關，表明樹皮越厚可能對低溫的耐受性更強。

表2 各低溫處理時長下的相對電導率與半致死時間、樹皮厚度之間的相關性分析

2.3 耐寒性聚類分析

根據(jù)42 份橡膠樹種質(zhì)資源的半致死時間，利用歐式距離（Euclidean distance）法進行聚類分析結果見圖1。聚類結果表明，當聚類閾值在5 左右的位置時，可將42 份種質(zhì)資源聚類成3 大組。其中第一組包含34 份種質(zhì)，占比最大（80.95%），結合表1 可知，該組的特點是耐寒性中等，該組下又可以劃分為2 個小組，耐寒性中上的有8 份，占總?cè)后w的19.05%，中下的有26 份，占總?cè)后w的45.24%，耐寒性較強的種質(zhì)占比相對較少。第2大組包含6 份種質(zhì)資源，耐寒性最差。第3 大組僅2 份種質(zhì)，耐寒性最強，占比僅4.76%。

圖1 42份橡膠樹種質(zhì)資源耐寒性聚類圖

3 小結

本試驗通過同一低溫下不同時長處理，對42份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源進行耐寒性比較，隨著處理時間的延長，各無性系枝條組織相對電導率呈“S”型變化趨勢。當處理時間為18 h 時，相對電導率的均值已近50%，整體開始表現(xiàn)對低溫的不耐受性，與本課題組之前結果（選用4 個品種進行室內(nèi)抗寒性測定，結果為以-2℃低溫處理15 h的條件快速鑒定橡膠樹種質(zhì)抗寒性［12］）存在一些差異，有待進一步探索驗證。

不同無性系的樹皮厚度變幅較大，且與半致死時間呈顯著正相關，樹皮厚度越厚，耐寒性表現(xiàn)越強，與本課題組之前的研究結果相符［8］，進一步說明在抗寒鑒定時可將樹皮厚度列為表觀形態(tài)篩選指標。

42 份種質(zhì)的半致死時間在9.34～30.49 h，各無性系間差異較大，均值為17.76 h，半致死時間高于18 h 的種質(zhì)有15 份，占總?cè)后w的35.71%。從半致死時間的聚類分析來看，耐寒性表現(xiàn)最強的一組僅2 份種質(zhì)，分別是170 號和189 號；耐寒性最差的有6 份；耐寒性中下等的無性系占比最多，占45.24%。從聚類占比可知，總?cè)后w中耐寒性強的種質(zhì)相對偏少?？紤]到橡膠樹對低溫脅迫時間段表現(xiàn)出的敏感性，根據(jù)本試驗結果，可選取在-2℃低溫下處理18～21 h 來快速篩選出耐寒性較強的種質(zhì)。

在同一低溫、不同處理時長條件下對大批量的橡膠樹種質(zhì)資源進行耐寒性鑒定具有省時省力、操作性強等特點。本研究僅對一年生苗期的耐寒性進行鑒定，后期可探討將此方法進一步運用于橡膠樹不同林齡的抗寒鑒定上，為縮短抗寒種質(zhì)鑒定時間及提高鑒定準確性提供理論依據(jù)。