李開宇 閆秀林 趙志剛

(大同市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,山西省大同市 037004)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種嚴重威脅人類生命健康的呼吸系統(tǒng)重癥疾病,主要臨床表現(xiàn)為呼吸衰竭、頑固性低氧血癥、呼吸窘迫,伴有胸悶、咳嗽、痰血,起病急、進展快,治療困難,預后差[1-2]。ARDS的致病因素較多,包括藥物中毒、外傷、胰腺炎等[3]。既往研究顯示,ARDS患者死亡多發(fā)生在發(fā)病后2～3周[4],目前臨床尚無有效的治療方案來提高ARDS患者的生存率。因此,探討ARDS病情嚴重程度及預后的相關預測指標有助于臨床醫(yī)生進行早期干預,改善患者的預后。HOX轉錄反義基因間RNA(HOX transcript anti-sense intergenic RNA,HOTAIR)是一種長度為2 148 nt的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),位于12q13.13染色體上,介于同源盒C(homebox C,HOXC)11和HOXC12基因之間,屬于致癌性lncRNA,在多種腫瘤中表達上調[5]。Wang等[6]的研究結果顯示,在經(jīng)脂多糖處理的MLE-12細胞和ARDS小鼠模型中HOTAIR表達水平升高,在MLE-12細胞及ARDS小鼠模型中敲除HOTAIR基因后可減弱脂多糖誘導的炎癥反應,從而緩解ARDS病情。miR-206位于人類染色體6q12上,是一種含有21個核苷酸序列的多功能miRNA,廣泛參與肺功能的調節(jié),例如其可以下調腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達,導致氣道平滑肌的神經(jīng)功能障礙,進而導致肺部炎癥性疾病,其還可以靶向抑制間隙連接蛋白43表達,調節(jié)肺泡氣血屏障的通透性[7]。研究表明,miR-206在支氣管、肺發(fā)育不良患者及急性肺損傷大鼠模型的外周血中表達下調,過表達miR-206能夠抑制纖維連接蛋白1(fibronectin 1,FN1)表達,抑制大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖并促進其凋亡[8]。本課題組通過ENCORI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),HOTAIR與miR-206具有互補序列,提示二者可能可以相互結合。有學者發(fā)現(xiàn),靶向調控HOTAIR/miR-206/FN1軸是治療心肌梗死的潛在方法[9],表明HOTAIR與miR-206存在靶向關系,并可能在相關疾病的診治中發(fā)揮作用。本研究通過檢測ARDS患者血清HOTAIR、miR-206的表達水平,分析二者與ARDS患者病情嚴重程度及入院28 d內(nèi)生存情況的關系,初步探討HOTAIR、miR-206在ARDS中的具體調控機制,同時為早期識別預后不良的高危患者提供新的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年10月至2021年10月在我院治療的110例ARDS患者作為研究對象。納入標準:(1)體征、病史及各項輔助檢查結果均符合ARDS診斷標準[10];(2)入院時發(fā)病時間≤24 h;(3)患者及家屬均知情同意;(4)全程在本院接受治療且配合本次研究;(5)無激素治療史。排除標準:(1)合并病毒性肝炎、嚴重瓣膜病、心源性或神經(jīng)源性肺水腫、支氣管哮喘、心律失常、感染、血液系統(tǒng)疾病、肺部腫瘤等的患者;(2)臨床診斷不明確的患者;(3)自動出院或不能配合本次研究的患者;(4)確診ARDS 24 h內(nèi)即死亡的患者;(5)嚴重精神障礙的患者。其中,男性58例、女性52例,年齡30～76(57.77±8.62)歲,體質指數(shù)18～26(23.08±2.46)kg/m2。本研究經(jīng)大同市第三人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 收集患者入院時的一般資料與臨床資料:一般資料包括年齡、性別、發(fā)病原因、合并基礎疾病、體質指數(shù)、吸煙史(吸煙史定義為每日吸煙1支以上,并持續(xù)1年以上)、飲酒史(飲酒史定義為每日乙醇攝入量超過40 g或每周飲酒量超過280 g,并持續(xù)1年以上)。查閱患者的電子病歷,收集其臨床資料,包括入院時心率、舒張壓、收縮壓、病因、呼吸頻率、基礎疾病、氧合指數(shù)[PaO2/吸入氧比例(fraction of inspiration oxygen,FiO2)]、急性生理與慢性健康評價Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ,APACHEⅡ)評分、血清白蛋白水平、動脈血pH值、空腹血糖水平、呼氣末正壓通氣(positive end-expiratory pressure ventilation,PEEP)。其中,APACHEⅡ總分范圍為0～71分,評分越高表明病情越嚴重,總分<15分為非重癥、≥15分則為重癥。使用弘盛GT6800監(jiān)護儀(濟寧弘盛醫(yī)療器械有限公司)測量患者入院時的PEEP。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測患者血清HOTAIR和miR-206的表達水平:采集患者入院次日早晨空腹外周血10 mL,4 ℃下以3 000 r/min離心10 min,取上層血清。采用總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司,批號:9112)從血清中提取總RNA,使用核酸測定儀(北京凱奧科技發(fā)展公司,型號:K5500)檢測RNA純度和濃度,然后取2 μg總RNA作為模板,經(jīng)過PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒(TaKaRa公司,貨號:6110A)逆轉錄得到cDNA,使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNase H Plus)(TaKaRa公司,貨號:RR820A)配置反應體系,選用GADPH作為內(nèi)參,通過LightCycler480實時熒光定量PCR儀擴增目的基因。取血清樣品,利用miRNA抽提試劑盒(康為世紀生物科技股份有限公司,批號:CW0627S)提取miRNA,取2 μg miRNA按照miRNA反轉錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號:KR211-02]說明書的操作標準將樣本miRNA反轉錄為cDNA,以U6為內(nèi)參,使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號:FP411-01]檢測血清miR-206的表達水平。反應體系為SYBR Mixture 10.0 μL,cDNA 2.0 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各2.0 μL,ddH2O 4.0 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共計40個循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法分別計算HOTAIR和miR-206基因的相對表達量,各引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 分組:參照參考文獻[4],根據(jù)入院時的PaO2/FiO2將ARDS患者分為ARDS輕度組(200 mmHg

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t法。采用COX回歸模型分析ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的影響因素。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清HOTAIR、miR-206表達水平預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的效能。采用Pearson法對ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達水平進行相關性分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同病情嚴重程度ARDS患者一般資料與臨床資料的比較 ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的APACHEⅡ評分、PEEP均依次升高(均P<0.05),但3組間的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、發(fā)病原因、合并基礎疾病、體質指數(shù)、心率、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖水平、動脈血pH值、血清白蛋白水平比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同病情嚴重程度ARDS患者一般資料與臨床資料的比較

2.2 不同病情嚴重程度ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達水平的比較 ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的血清HOTAIR表達水平依次升高,而血清miR-206表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 不同病情嚴重程度ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達水平的比較(x±s)

2.3 不同臨床結局ARDS患者一般資料與臨床資料的比較 與生存組相比,死亡組患者的APACHEⅡ評分、PEEP均升高,PaO2/FiO2降低(均P<0.05),兩組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、發(fā)病原因、合并基礎疾病、體質指數(shù)、心率、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖水平、動脈血pH值、血清白蛋白水平的比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 不同臨床結局ARDS患者一般資與臨床資料的比較

2.4 不同臨床結局ARDS患者血清HOTAIR和miR-206表達水平的比較 相比于生存組,死亡組患者的血清HOTAIR表達水平更高,血清miR-206表達水平更低(均P<0.05)。見表5。

表5 不同臨床結局ARDS患者血清HOTAIR、miR-206表達水平的比較(x±s)

2.5 COX回歸分析 將2.3及2.4中具有統(tǒng)計學意義的APACHEⅡ評分(實測值)、PEEP(實測值)、PaO2/FiO2(實測值)、血清miR-206表達水平(實測值)、血清HOTAIR表達水平(實測值)作為自變量,以ARDS患者的臨床結局為因變量(死亡=1,存活=0),納入COX回歸模型進行分析。結果顯示,APACHEⅡ評分、PaO2/FiO2、血清HOTAIR表達水平、血清miR-206表達水平均是ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的影響因素(均P<0.05)。見表6。

表6 ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡影響因素的COX回歸分析

2.6 血清HOTAIR和miR-206表達水平預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的效能 ROC曲線分析結果顯示,血清HOTAIR表達水平、血清miR-206表達水平及兩者聯(lián)合預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.845(95%CI:0.765,0.926)、0.837(95%CI:0.760,0.913)、0.943(95%CI:0.899,0.987),特異度分別為87.80%、71.60%、89.20%,敏感度分別為75.00%、83.30%、91.70%,最大約登指數(shù)分別為0.628、0.549、0.809。見圖1。

圖1 血清HOTAIR和miR-206表達水平預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的ROC曲線圖

2.7 血清HOTAIR和miR-206表達水平的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示,ARDS患者血清HOTAIR的表達水平與血清miR-206的表達水平呈負相關(r=-0.646,P<0.001),見圖2。

圖2 ARDS患者血清HOTAIR與miR-206表達水平的相關性分析

3 討 論

ARDS是一種以呼吸系統(tǒng)衰竭為特征的急性彌漫性肺損傷,常見于重癥監(jiān)護室患者,由直接肺損傷(肺炎、誤吸等)或間接肺損傷(敗血癥、外傷等)引起,發(fā)病機制復雜,致殘率與致死率均較高[11]。盡管目前ARDS的早期診斷和治療手段已取得較大進步,但尚無直接針對ARDS病理機制的有效治療方法,大部分患者的臨床轉歸仍不理想。另外,ARDS患者雖然經(jīng)治療后肺功能可有不同程度的恢復,但是仍有超過50%的患者在患病兩年后出現(xiàn)呼吸功能下降,25%～78%的患者在患病1年內(nèi)出現(xiàn)認知功能障礙,部分患者伴有抑郁、焦慮等不良心理癥狀[12]。目前臨床上主要采用APACHEⅡ評分和Murray肺損傷評分系統(tǒng)來評估ARDS患者的預后,但二者具有主觀性,特異性較差,例如APACHEⅡ評分并不能特異性區(qū)分膿毒癥、ARDS或急性腎損傷[13]。因此,亟須尋找特異性指標來準確識別高危ARDS患者,及時調整臨床治療策略,以改善ARDS患者的預后。

ARDS疾病進展與炎癥反應密切相關,炎癥反應可以引起肺泡上皮和內(nèi)皮細胞通透性增加,導致肺水腫發(fā)生,加重肺部損傷[11]。研究表明,lncRNA可以通過調控mRNA的穩(wěn)定性及表達水平,以及競爭性結合miRNA等途徑,來參與ARDS患者免疫炎癥反應、細胞組織修復、血管內(nèi)皮損傷等病理過程[14]。Yao等[15]發(fā)現(xiàn),lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本1可以通過靶向調控miR-150-5p來參與ARDS小鼠模型的肺損傷,提示lncRNA可以靶向結合miRNA來調控ARDS的病理過程。HOTAIR是一種與細胞周期、炎癥反應、基因沉默、神經(jīng)元功能等相關的lncRNA,有研究表明,HOTAIR參與脂多糖誘導的多種炎癥損傷信號通路的調控過程,如脂多糖誘導的小鼠軟骨細胞炎癥損傷[16]。有學者發(fā)現(xiàn),HOTAIR在脂多糖誘導的急性肺損傷動物模型中表達上調,HOTAIR被敲除后可減輕脂多糖誘導的急性肺損傷,進一步的功能試驗表明HOTAIR通過調節(jié)miR-17-5p來影響細胞的自噬和生物學活動,從而促進脂多糖誘導的急性肺損傷[17]。此外,還有學者發(fā)現(xiàn)HOTAIR在脂多糖處理的MLE-12細胞和ARDS小鼠模型中的表達上調[6]。本研究結果顯示,ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的血清HOTAIR表達水平依次升高(均P<0.05),說明HOTAIR的表達水平可能與ARDS患者的病情嚴重程度有關,其表達水平越高,患者的病情越嚴重。Wang等[6]的研究發(fā)現(xiàn),抑制HOTAIR可調節(jié)miR-30a-5p/磷酸二脂酶7A軸,減輕ARDS小鼠模型體內(nèi)的炎癥反應,這提示HOTAIR可能是通過靶向調控下游miRNA,間接調控與ARDS發(fā)生及發(fā)展相關的mRNA,從而參與ARDS的進展。生物信息學分析結果顯示,HOTAIR與miR-206核酸序列存在結合位點。miR-206被證實是一種抑癌因子,可抑制多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18]。研究表明,miR-206廣泛參與肺功能調節(jié)[19-20],還在炎癥過程中扮演重要角色[21]。本研究結果顯示,ARDS輕度組、ARDS中度組、ARDS重度組患者的血清miR-206表達水平依次降低(均P<0.05),說明miR-206可能參與ARDS的發(fā)展,且其表達水平可反映ARDS病情嚴重程度。

本研究還根據(jù)ARDS患者的臨床結局進行分組,結果顯示,相比于生存組,死亡組患者的血清HOTAIR表達水平更高,血清miR-206表達水平更低(均P<0.05),說明血清HOTAIR及miR-206的表達水平與ARDS患者的預后相關。進一步行COX回歸分析,結果顯示,血清HOTAIR表達水平升高及血清miR-206表達水平降低均是ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的危險因素(均P<0.05),提示二者或許可以作為ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的預測指標。本研究ROC曲線分析結果顯示,血清HOTAIR表達水平及血清miR-206表達水平預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的AUC分別為0.845、0.837,說明血清HOTAIR及miR-206表達水平單獨預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡情況具有一定的價值,但診斷效能中等(AUC均<0.9),而二者聯(lián)合預測ARDS患者入院28 d內(nèi)死亡的AUC為0.943,且敏感度與特異度均較單獨檢測更高,說明血清HOTAIR與miR-206表達水平聯(lián)合檢測預測ARDS患者預后的效能更高。這提示,對于血清HOTAIR呈高表達、血清miR-206呈低表達的ARDS患者,臨床醫(yī)護人員應給予高度警惕,制訂好治療策略,以降低患者的死亡率。本研究進一步行相關分析發(fā)現(xiàn),ARDS患者血清HOTAIR表達水平與血清miR-206表達水平呈負相關(P<0.05),提示HOTAIR、miR-206可能共同參與ARDS中的炎癥反應。然而,HOTAIR是否能夠靶向調控miR-206進而參與ARDS發(fā)病過程,還需要通過體外細胞實驗進一步證實。

綜上所述,血清HOTAIR、miR-206的表達水平與ARDS患者的病情嚴重程度及預后密切相關,血清HOTAIR表達水平升高及血清miR-206表達水平降低均是ARDS患者入院28d內(nèi)死亡的危險因素,且ARDS患者血清HOTAIR表達水平與血清miR-206表達水平呈負相關,二者聯(lián)合檢測對ARDS患者的預后具有較好的預測價值,為ARDS發(fā)病機制的研究及治療提供新的思路。但本研究納入病例數(shù)較少,未來還需要加大樣本量進行深入研究,且HOTAIR、miR-206在ARDS中的具體調控機制及應用價值還需要進一步探討。