陳蘭蘭，陳榮榮，原夢雪，張銘，王安琪，李莉

山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西太原 030024

變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）是機體接觸過敏原后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥，通常以鼻癢、打噴嚏、流清水涕、鼻塞等為主要就診表現(xiàn)，在耳鼻喉科較為常見且多發(fā)[1]。在中國，約有1.9億成人和2.2億兒童患有變應(yīng)性鼻炎，占中國總?cè)丝诘?3.26%和15.79%，而全球患病率也高達10%～40%[2-3]。受環(huán)境因素和生活習(xí)慣的影響，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病數(shù)量也逐年增多，給患者的工作效率、生活質(zhì)量等產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響，此外，變應(yīng)性鼻炎治療不當(dāng)還可引起哮喘的發(fā)作和影響其控制[4]，為此變應(yīng)性鼻炎在全球公共衛(wèi)生隱患中受到極大關(guān)注。

麻黃附子細辛湯出自張仲景的《傷寒論》，可達到溫經(jīng)解表、宣肺散寒、扶正祛邪的作用，方中麻黃可發(fā)汗解表；附子可有溫經(jīng)通脈、助陽散寒之效；細辛能夠散寒解表、宣通鼻竅[5]。據(jù)相關(guān)文獻表明[6]，麻黃附子細辛湯能夠升高AR大鼠血漿中IFN-γ含量，降低IL-13含量，以達到恢復(fù)Th1/Th2免疫失衡狀態(tài)的效果，提示了麻黃附子細辛湯可以對變應(yīng)性鼻炎起到良好的免疫調(diào)節(jié)作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一名詞由英國研究者Hopkins AL初次提出，它是基于系統(tǒng)生物信息學(xué)，通過綜合運用各類組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)可視化等技術(shù)[7]，建立“中藥復(fù)方成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，多成分、多靶點、系統(tǒng)性地對中藥復(fù)方治療疾病的分子機制進行研究分析，對中藥復(fù)方配伍及中醫(yī)整體觀念的研究具有獨特的優(yōu)勢[8]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)推測麻黃附子細辛湯醫(yī)治變應(yīng)性鼻炎的潛在分子機制，為后期相關(guān)研究提供理論依據(jù)和新的研究思路。

資料與方法

1 麻黃附子細辛湯活性成分的篩選

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以“麻黃（Mahuang）”、“附子（Fuzi）”、“細辛（Xixin）”為關(guān)鍵詞，搜索出各中藥的所有活性成分以及各成分的口服生物利用度（OB）和藥物相似性（DL）。根據(jù)相關(guān)文獻[9]，設(shè)定兩個閾值進行篩選，即：OB≥30%、DL≥0.18，對搜索到的化合物進行過濾。

2 中藥活性成分作用靶標(biāo)的預(yù)測

利用TCMSP平臺，挑選得到候選活性化合物所對應(yīng)的潛在靶標(biāo)，并將其輸入UniProt平臺（http：//www.uniprot.org/）中的UniProt知識庫（UniProt KB），設(shè)定物種為人，最后將查詢到的所有化合物活性成分靶點統(tǒng)一進行標(biāo)準(zhǔn)化。

3 AR疾病相關(guān)靶蛋白的收集

以“allergic rhinitis”作為檢索詞，分別在Dis-GeNET平臺（https：//www.disgenet.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）以及GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）進行檢索，以獲得目前已知的與變應(yīng)性鼻炎相關(guān)的疾病靶點。根據(jù)相關(guān)文獻[10]，score值越高則表示該靶標(biāo)與疾病的聯(lián)系越緊密，若得到的靶標(biāo)過多則按照score值＞中位數(shù)的靶標(biāo)作為該疾病的潛在靶標(biāo)。

4 關(guān)鍵靶點的篩選

為明確變應(yīng)性鼻炎相關(guān)靶點與麻黃附子細辛湯潛在靶點的相互作用，利用R軟件程序包對疾病靶點與麻黃附子細辛湯中藥物活性成分預(yù)測靶點取交集并繪出韋恩圖。

5 PPI拓?fù)鋵W(xué)分析

以基因名的形式將篩選得到的關(guān)鍵靶點上傳到String平臺（https：//string-db.org /），建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein protein interaction，PPI），最后將獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape軟件進行拓?fù)鋵W(xué)分析。

6 藥物-疾病共同靶點基因本體功能（GO）與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

借助基迪奧生物信息云平臺（OmicShare）（https：//www.omicshare.com/），對藥物-疾病共同靶點進行GO富集分析和KEGG信號通路分析，將結(jié)果按P值的大小排序，取前20條通路進行可視化分析。

7 麻黃附子細辛湯治療AR相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

依托Cytoscape（3.8.0）軟件分別建立出麻黃附子細辛湯的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖和麻黃附子細辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。圖中的節(jié)點（node）是活性成分、靶點等，而節(jié)點與節(jié)點之間的連接則稱為邊（edge）。節(jié)點的大小及連接的線條代表節(jié)點之間的聯(lián)系，節(jié)點越大或線條連接得越多表示該節(jié)點越重要。

8 分子對接驗證

從PubChem平臺獲取麻黃附子細辛湯治療AR關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)，再利用ChemOffice將其進行優(yōu)化。在RCSB PDB平臺下載AR關(guān)鍵靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，并利用PyMOL軟件去除水分子和無效小分子配體。依托AutoDock（1.5.6）工具和Vina進行分子對接，獲得關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶蛋白的對接效果，并將最佳構(gòu)象利用PyMOL工具進行可視化展示。

結(jié) 果

1 麻黃附子細辛湯中活性成分及預(yù)測靶點的獲取

在TCMSP平臺中共篩選出麻黃附子細辛湯的已知化學(xué)成分620種，包括麻黃363種，附子65種，細辛192種。在通過了以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件后，總共獲得了麻黃附子細辛湯52個活性成分，其中來源于麻黃23個，附子21個，細辛8個，列出主要的中藥活性成分，內(nèi)容見表1。查詢出麻黃附子細辛湯蛋白靶點共計227個，并將預(yù)測出的所有蛋白靶點名稱借助UniProt平臺（http：//www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)換為基因名。

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2 疾病靶點的獲取及核心靶點的篩選

依托DisGeNET、OMIM以及GeneCards平臺，分別在上述數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)頁檢索框中輸入關(guān)鍵詞“allergic rhinitis”后，得到的靶點個數(shù)分別為446、1、1034，匯總?cè)ブ睾?，得?01個疾病靶點。將得到的301個疾病靶點與227個藥物活性成分靶點借助R軟件取交集并繪制韋恩圖（見圖1）。結(jié)果獲得30個藥物活性成分與疾病的共同靶點，即：PTGS2、ADRB2、DPP4、PPARG、NOS2、BCL2、ICAM1、GSTP1、AHR、AKR1B1、VEGFA、PLAU、MMP9、MAPK1、HIF1A、IL1B、CCL2、CXCL8、IL2RA、PLAT、SERPINE1、IFNG、IL1A、PARP1、PPARA、SPP1、IL4、CHRM3、CAT、NOX1。將篩選得到的關(guān)鍵靶點以基因名的形式上傳到String平臺并進行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 PPI拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果圖

圖3 生物過程（BP）

圖4 分子功能（MF）

圖5 細胞組成（CC）

3 基因本體功能與通路富集分析

借助基迪奧生物信息云平臺（OmicShare）（https：//www.omicshare.com/）對麻黃附子細辛湯與變應(yīng)性鼻炎的30個共同靶點進行基因本體功能（GO）富集分析和KEGG通路分析。將所得的結(jié)果根據(jù)P值的大小排列，并依次以排序前20項的條目形式列出生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）以及細胞組成（Cellular Component，CC），并依次繪出柱狀圖，見圖3-5。結(jié)果顯示，在藥物-疾病共同靶點上共富集的生物學(xué)過程17743條，分子功能過程18408條，細胞組成18579條。其中主要涉及的生物學(xué)過程有：細胞對外界刺激的反應(yīng)、細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、細胞對有機物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)等；主要涉及的分子功能有：細胞因子活性、信號受體結(jié)合、受體配體的活性、受體調(diào)節(jié)器活性、細胞因子受體結(jié)合等；主要涉及的細胞組成有：細胞外間隙、胞外區(qū)部分、質(zhì)膜外側(cè)、富含ficolin-1的顆粒管腔、分泌顆粒等；在進行藥物-疾病共同靶點KEGG通路分析后，共富集出197條通路，其中排名前20條的為：流體剪切力和動脈粥樣硬化、AGE- RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、IL-17信號通路、癌癥、美洲錐蟲病、Th17細胞分化、HIF-1信號通路等，見表2，將結(jié)果繪制成氣泡圖，見圖6。

圖6 KEGG前20條氣泡圖

圖7 麻黃附子細辛湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

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4 相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

依托Cytoscape（3.8.0）工具分別建立出麻黃附子細辛湯的活性成分-靶點圖和麻黃附子細辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7-8。其中，麻黃附子細辛湯的活性成分-靶點圖中共有60個節(jié)點（node）和104條邊（edge），麻黃附子細辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖中共有51個節(jié)點和170條邊。

5 分子對接驗證結(jié)果

將PPI拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果中5個節(jié)點度最高的靶蛋白（IL1B、VEGFA、PTGS2、HIF1A、ICAM1）與“麻黃附子細辛湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”中的主要化合物kaempferol（山奈酚）、quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）分別依次在AutoDock（1.5.6）軟件中進行分子對接驗證。結(jié)果見表3。當(dāng)受體與配體的結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol時則表示分子與蛋白靶點之間具有較好的結(jié)合活性[11]。驗證結(jié)果顯示，麻黃附子細辛湯主要活性成分與AR疾病關(guān)鍵靶點的結(jié)合活性在-5.7kcal/mol至-9.6kcal/mol之間，表明麻黃附子細辛湯主要活性成分與AR疾病關(guān)鍵靶點之間形成的構(gòu)象結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較好的結(jié)合活性。另外，由表3可見，luteolin（木犀草素）與5個靶蛋白結(jié)合能最低，利用PyMOL軟件對木犀草素與核心靶蛋白的最佳結(jié)合構(gòu)象進行可視化分析，見圖9。

表3 主要化合物與核心靶蛋白分子對接結(jié)果

圖9 木犀草素與核心靶蛋白對接圖

討 論

變應(yīng)性鼻炎屬于中醫(yī)“鼻鼽”“鼽嚏”等范疇，大量研究表明，運用麻黃附子細辛湯治療變應(yīng)性鼻炎能取得一定的療效。方中麻黃是麻黃科植物的干燥草質(zhì)莖，麻黃的主要化學(xué)成分為生物堿、黃酮類、揮發(fā)油類等，具有平喘、發(fā)汗、利尿、抗炎抗過敏等作用[12]，其中，麻黃中的水提物和乙醇提取物可抑制肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺等化學(xué)介質(zhì)，具有抗變態(tài)反應(yīng)的作用[13]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示[14]，附子具有強心、抗癌、抗炎等作用；細辛能夠抗病毒抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等，其中，細辛中的甲基丁香酚、芝麻脂素具有明顯的抗炎作用[15]。

本研究中藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示，麻黃附子細辛湯治療AR的主要化合物依次為槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、豆甾醇等。槲皮素是一種天然存在的多酚類黃酮化合物，它可以抑制組胺等化學(xué)介質(zhì)的產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)Th1/Th2的穩(wěn)定性，具有抗氧化、抗炎抗過敏以及免疫調(diào)節(jié)的作用，對相關(guān)的變應(yīng)性疾病有著廣泛的應(yīng)用[16]。木犀草素主要通過調(diào)節(jié)NF-κB、AP-1、STAT3等轉(zhuǎn)錄因子達到一定的抗炎作用，有研究表明木犀草素可通過調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠的 TLR4/NF-κB 信號通路和調(diào)整Th1/Th2 失衡狀態(tài)以改善鼻黏膜炎癥[17]。山奈酚可降低小鼠血清中的組胺、腫瘤壞死因子-α、IL- 8等，具有抗過敏作用[18]。柚皮素能顯著改善變應(yīng)性鼻炎大鼠的鼻黏膜組織，且能降低大鼠血清中IgE、IL4及IL5值，對變應(yīng)性鼻炎大鼠具有一定的保護作用[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在獲得的主要活性成分中，大多來源于麻黃，這可能與麻黃在研究變應(yīng)性鼻炎方面更為廣泛有關(guān)。在對得到的30個核心靶點進行拓?fù)鋵W(xué)分析后顯示，VEGF-A、IL1B、PTGS2、HIF1A、等可能是麻黃附子細辛湯發(fā)揮治療AR作用的重要靶點，其中血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）是VEGF家族中研究最多的一種，具有促進血管生成、增加血管通透性、參與血管重塑以及促進受損黏膜組織修復(fù)等作用[20]，相關(guān)研究顯示，血管內(nèi)皮生長因子在變應(yīng)性鼻炎患者中有較高的表達[21]，說明VEGF-A與變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜重塑有關(guān)。IL1B基因中第5外顯子rs1143634使IL-1β分泌增加，而在變應(yīng)性鼻炎患者抗原激發(fā)后其鼻腔分泌物中IL-1β水平會顯著增高，亦有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β與過敏性疾病的炎癥進展呈現(xiàn)正相關(guān)，這說明IL1B與變應(yīng)性鼻炎的炎癥有著密切的聯(lián)系[22-23]。綜上，麻黃附子細辛湯的多個核心靶點對變應(yīng)性鼻炎的炎癥狀態(tài)、鼻黏膜重塑、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用。

通過富集分析，得出197條麻黃附子細辛湯與變應(yīng)性鼻炎相關(guān)的通路。其中流體剪切力和動脈粥樣硬化這一信號通路為麻黃附子細辛湯對變應(yīng)性鼻炎的第一作用通路，流體剪切力和動脈粥樣硬化與NF-κB炎癥信號的激活有關(guān)[24]。AGE-RAGE信號通路與神經(jīng)和外周血管的修復(fù)、再生密切相關(guān)[25]，有研究報告，AGE-RAGEs影響著細胞的凋亡和增殖、參與細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)過程[26]。IL-17信號通路是變應(yīng)性鼻炎機制研究較多的通路之一，是由T輔助細胞（Th17）產(chǎn)生，可激活NF-κB、MAPKs等多種信號通路以誘導(dǎo)促炎趨化因子和細胞因子的表達，在防御反應(yīng)、過敏性疾病以及自身免疫疾病中起著重要作用[27-28]。從富集結(jié)果來看，對麻黃附子細辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的研究主要可以通過流體剪切力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、IL-17信號通路、癌癥、美洲錐蟲病、Th17細胞分化、HIF-1信號通路等進行。

在得到的分子對接結(jié)合能中，我們發(fā)現(xiàn)木犀草素與5個關(guān)鍵靶蛋白的總結(jié)合能最高，說明木犀草素可能是麻黃附子細辛湯治療AR的核心化合物。

借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)對麻黃附子細辛湯治療AR的分子機制從多成分、多靶點、多信號通路進行預(yù)測，為麻黃附子細辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的作用機制提供了一定的理論依據(jù)和研究方向。但由于本研究主要借助相關(guān)網(wǎng)絡(luò)平臺信息，對獲得的結(jié)論還需通過相關(guān)實驗進行進一步驗證。