于瀾，楊少鋒

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410208

頸椎病[1]（Cervical spondylosis）是由于頸椎退行性改變或是周圍組織病理改變，影響周圍的神經(jīng)、血管等，導(dǎo)致一系列癥狀和體征。近些年來，頸椎病的發(fā)病率逐年呈遞增的趨勢。近年來，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)癥治療頸椎病的局限性和不穩(wěn)定性以及臨床治療模式的轉(zhuǎn)型[2]，在頸椎病的前期治療及延緩疾病發(fā)展過程中，中醫(yī)藥治療[3]具有整體辨證、使用方便、療效突出、價(jià)格低廉等優(yōu)勢受到廣泛認(rèn)可；但是中醫(yī)藥治療頸椎病的科學(xué)性備受質(zhì)疑，故因此利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究中藥復(fù)方治療頸椎病的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。頸椎病在中醫(yī)中屬于“項(xiàng)痹”范疇[4]，氣血受到風(fēng)寒濕阻滯，周圍筋肉無以濡養(yǎng)，而出現(xiàn)頸部酸脹痛，伴隨眩暈、手部疼痛和麻木，活動(dòng)欠佳的癥狀。

附子湯[5]出自《傷寒雜病論》，原文論述為“少陰病，身體痛，手足寒，骨節(jié)痛，脈沉者，附子湯主之”，具有溫經(jīng)助陽，祛寒除濕的功效。本課題組[6-9]運(yùn)用六經(jīng)辨證在臨床上運(yùn)用經(jīng)方治療頸椎病取得了較好的療效，現(xiàn)代研究也證實(shí)[10]附子湯具有抗炎、止痛、調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨代謝等作用，但是附子湯治療頸椎病的作用機(jī)制還未明確，因此本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步預(yù)測附子湯的活性化合物及治療頸椎病的靶點(diǎn)，然后通過分子對(duì)接驗(yàn)證，為附子湯治療頸椎病提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1 附子湯中藥化學(xué)活性成分及作用靶點(diǎn)的挖掘篩選

在TCMSP[11]（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中以藥物口服生物利用度 （oral bioavailability，OB）≥ 30%，藥物相似性 （drug likennss，DL）≥ 0.18，作為篩選參數(shù)分別檢索附子湯的成分“附子、茯苓、人參、白術(shù)、芍藥”的活性成分。將上述在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得的活性成分按Related Targets獲得相應(yīng)的疾病作用藥靶，在UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，篩選物種為“homo sapiens”的靶點(diǎn)，獲得公認(rèn)的gene symbol。

2 頸椎病疾病靶點(diǎn)收集與篩選

通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：/www.omim.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）、Drugebank（https：//go.drugbank.com/）、CTD[12]數(shù)據(jù)庫。搜索 “cervical myelopathy”或”cervical spondylosis”，獲得頸椎病疾病靶點(diǎn)，通過去除重復(fù)靶點(diǎn)及將重復(fù)靶點(diǎn)在UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，篩選物種為“homo sapiens”的靶點(diǎn)，獲得官方頸椎病疾病靶點(diǎn)。并將附子湯藥物的作用靶點(diǎn)與頸椎病疾病靶點(diǎn)上傳至Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得交集為附子湯治療頸椎病的潛在作用靶點(diǎn)（核心基因）。

3 KEGG通路和GO富集分析

將上述獲的核心基因運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/gp/index.html）做GO富集分析與KEGG富集分析，F(xiàn)DR ＜ 0.05代表富集結(jié)果顯著。最后利用R語言繪制 GO 富集分析氣泡圖及KEGG富集分析氣泡圖。

4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述獲得的核心基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫Version11.0（http：//STR-ING-db.org）對(duì)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（protein-proteininteraction，PPI）預(yù)測，選擇“homo sapiens”的參數(shù)，設(shè)置互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，獲得蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)，在Cytoscape 3.7.1軟件中打開蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，節(jié)點(diǎn)的大小顏色代表結(jié)合分?jǐn)?shù)高低，節(jié)點(diǎn)的連線代表結(jié)合分?jǐn)?shù)高低，獲得PPI圖。

5 附子湯作用于頸椎病“藥物-活性成分-疾病作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Excel中建立復(fù)方與單味中藥、單味中藥與活性成分、活性成分與作用靶點(diǎn)、疾病與疾病致病靶點(diǎn)關(guān)系數(shù)據(jù)，利用Cytoscape3.7.1軟件打開數(shù)據(jù)構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analyzsis計(jì)算單個(gè)節(jié)點(diǎn)Degree值。

6 核心分子對(duì)接驗(yàn)證

將上述Degree數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，挑選Degree值位于位于前10的core gene，在PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫，選擇“homo sapiens”的參數(shù)，下載核心蛋白的基因3D結(jié)構(gòu)（.PDB格式）；挑選Degree值位于前10的中藥活性成分，在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，下載活性成分小分子化合物結(jié)構(gòu)（.mol2格式），利用PyMOL軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6軟件將化合物及核心蛋白基因pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式，最后進(jìn)行利用Vina進(jìn)行對(duì)接，評(píng)估對(duì)接binding energy，選取結(jié)合能≤ -5.0 kJ/mol 的活性成分作為附子湯治療頸椎病靶點(diǎn)的篩選依據(jù)，并用PyMOL軟件建立對(duì)接模式圖。

結(jié) 果

1 復(fù)方活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得活性化合物，剔除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分，共獲得38個(gè)活性成分，其中白芍8個(gè)，白術(shù)4個(gè)，茯苓6個(gè)，附子6個(gè)，人參17個(gè)。其中白芍和人參活性成分重合β-谷固醇（betasitosterol）、谷甾醇（kaempferol），白芍和附子活性成分重合谷甾醇（sitosterol）?；钚猿煞值幕拘畔⒁姳?，下表僅列出Degree值前12活性成分。

表1 degree值排名前12的活性成分的基本信息

表2 6個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

2 附子湯藥效靶點(diǎn)及預(yù)測疾病治療靶點(diǎn)結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN數(shù)據(jù)庫預(yù)測到109個(gè)附子湯藥物靶標(biāo)，檢索GeneCards、OMIM、Drugebank、DisGeNET、CTD數(shù)據(jù)庫分別檢索疾病靶標(biāo)，剔除重復(fù)檢索的靶標(biāo)，上傳至Uniport數(shù)據(jù)庫，得到“homo sapiens”。致病靶標(biāo)976個(gè)。

3 附子湯-頸椎病交集靶點(diǎn)Venny圖

運(yùn)用Venny平臺(tái)，得到附子湯與頸椎病的交集基因16個(gè)，見圖1。下載交集數(shù)據(jù)，后續(xù)進(jìn)行GO、KEGG分析。

圖1 附子湯-頸椎病Venny

4 KEGG通路和GO富集分析結(jié)果

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)上述交集潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。該富集分析中，GO條目283個(gè)，包括生物過程（biological process，BP）主要是對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）涉及膜筏、膜微區(qū)等；分子功能（molecular function，MF）涉及蛋白激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。根據(jù)P＜0.01，分別取排名前20的條目進(jìn)行可視化分析，見圖2。KEGG條目55條，信號(hào)通路主要涉及TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、c-type lectin receptor信號(hào)通路等。

圖2 GO富集分析氣泡

圖3 附子湯交集靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 藥物-活性成分-疾病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建模塊

將在Venny平臺(tái)下載得到的16個(gè)交集基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有節(jié)點(diǎn)16個(gè)，線條數(shù)53條，平均節(jié)點(diǎn)度：6.62，取BetweennessCentrality值＞0.0126012，ClosenessCentrality值＞0.55801105，Degree值＞1倍中位數(shù)值7，得到IL6、IL1B、PTGS2、CASP3、CASP1、VCAM1這些靶點(diǎn)可認(rèn)為是附子湯治療頸椎病中發(fā)揮重要作用。

6 附子湯作用于頸椎病“藥物-活性成分-疾病”作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.0軟件對(duì)藥物-活性成分-疾病進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中深藍(lán)色倒三角為附子湯，深藍(lán)色三角形為頸椎病，淺藍(lán)色矩形為各藥味名稱，深紅色矩形為藥物共用活性成分和疾病致病靶點(diǎn)，其余淡紅色矩形代表藥物共有活性成分。節(jié)點(diǎn)之間連線表明藥物-活性成分-疾病之間的靶向關(guān)系，連線越多越密集，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越占據(jù)核心地位。

7 分子對(duì)接結(jié)果

將附子湯篩選得到的10個(gè)核心靶點(diǎn)及核心活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，其中核心靶點(diǎn)的基本信息見下表3，橫坐標(biāo)為核心蛋白，縱坐標(biāo)為核心活性成分作結(jié)合能熱值圖，如圖5。分子對(duì)接結(jié)果中，絕大部分分子結(jié)合能＜-5.0 kJ/mol，其中Fumarine、Inermin、Frutinone A、Deltoin、Girinimbin與4個(gè)蛋白結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol，beta-sitosterol、Stigmasterol除與CASP3外，其余結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol，表明這些活性成分與靶點(diǎn)有更佳的結(jié)合能力，可能為附子湯作用于頸椎病的關(guān)鍵活性成分。繪制每個(gè)活性物質(zhì)對(duì)接最低結(jié)合能對(duì)接模式圖，見圖6。

圖5 附子湯中活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能熱

圖6 每個(gè)結(jié)合能最低的活性成分-靶點(diǎn)

討 論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，探討附子湯治療頸椎病的作用機(jī)制，從單味中藥與靶點(diǎn)匹配結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，丁香酮 A、普羅托品、β-谷甾醇、豆甾醇等能夠匹配較多靶點(diǎn)，可能為附子湯治療頸椎病的關(guān)鍵活性成分，丁香酮A有多種生物活性，包括抗氧化以減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥的發(fā)生，軟骨細(xì)胞的凋亡來治療關(guān)節(jié)炎；普羅托品[13]通過抑制核因子-κB信號(hào)通路，從而減弱促炎酶、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，導(dǎo)致促炎介質(zhì)的下調(diào)，進(jìn)而用于關(guān)節(jié)炎的防治；此外，普羅托品具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。在免疫系統(tǒng)中起主要作用TOLL樣受體4（TLR4）是脂多糖的識(shí)別受體，炎癥刺激脂多糖TOLL受體后，核因子κB信號(hào)通路被激活[15]，并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和化學(xué)誘導(dǎo)劑的產(chǎn)生[16]，另外，其減少炎癥介質(zhì)如前列腺素釋放，致體內(nèi)環(huán)氧合酶-2含量下調(diào)，增加抗炎因子基因表達(dá)水平[17]；β-谷甾醇具有抗炎、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)傷口愈合等廣泛的生物作用[18]，此外，其通過提升機(jī)體氧自由基（OFR）的清除能力，促使血清NO含量升高，抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）的聚集與釋放[19]，例如黃建春[20]等發(fā)現(xiàn)豆甾醇能夠清除O2和·OH等自由基，并且高濃度的豆甾醇具有明顯的抑制效應(yīng)，具有抗氧化作用；0.3～3mg/kg豆甾醇對(duì)明顯鎮(zhèn)痛作用[21]。

炎癥發(fā)生細(xì)胞因子刺激活性氧的生成[22]，這種活性氧體內(nèi)水平上調(diào)可以促使細(xì)胞凋亡，可以激活包括NF-κB的通路、TNF信號(hào)通路等多種信號(hào)通路[23]。實(shí)驗(yàn)證明，NF-κB的通路調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致頸椎退行性病變[24]，當(dāng)抑制NF-κB活性后，IL-6等炎性因子的表達(dá)水平明顯降低[25]，干預(yù)NF-κB信號(hào)通路的下調(diào)PAR2可有效延緩炎癥的發(fā)展[26]。研究表明[27]，在頸椎病患者中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子指標(biāo)顯著升高，其通過誘導(dǎo)神經(jīng)根鞘損傷影響神經(jīng)傳導(dǎo)功能。其次，TNF-α機(jī)體水平越高，神經(jīng)根性疼痛越明顯[27]。

分子對(duì)接分析提示，PTGS1、PTGS2、CASP3等頸椎病致病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，PTGS酶又名環(huán)氧合酶，分為兩個(gè)種類，即結(jié)構(gòu)型的PTGS1和誘導(dǎo)型的PTGS2，能夠合成前列腺素[28]，頸椎病的發(fā)生發(fā)展是由于椎間盤周圍組織退行性變，或內(nèi)外壓力失衡，出現(xiàn)椎體周圍組織不穩(wěn)后，導(dǎo)致的創(chuàng)傷性炎癥[29]，人體是一個(gè)有機(jī)整體，長期炎性刺激促使機(jī)體代償性構(gòu)建椎旁穩(wěn)定[30]，故椎間盤的退行性變，椎間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)不是引起頸椎病的主要原因，其次與釋放的炎性因子有關(guān)[31]，PTGS1也被認(rèn)為在炎癥、關(guān)節(jié)炎和癌癥的病理生理過程中起關(guān)鍵作用[32]。研究表明，在炎癥介質(zhì)下，PTGS2的表達(dá)上調(diào)[33]。CASP3蛋白為天冬氨酸特異酶、半胱氨酸蛋白酶 （Caspases）的家族蛋白，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[34]，此外，炎癥反應(yīng)和MAPK通路的激活均有CASP3的參與[35]。

綜上，附子湯可能是通過影響NF-κB的通路、TNF信號(hào)通路來緩解頸椎間盤中的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)頸椎病有較好的臨床效果，然而，本研究是基于有限的生物數(shù)據(jù)庫中收錄內(nèi)容，可能會(huì)造成結(jié)果的偏倚，此外，分子對(duì)接技術(shù)是通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)而實(shí)現(xiàn)，因此最終附子湯治療頸椎病的藥物活性成分、靶點(diǎn)、機(jī)制等還需要后期可通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，為附子湯治療頸椎病提供更充分的科學(xué)依據(jù)。