郭美玲 龐月 劉芯睿 劉玉茹 薛淑霞 孫金生

摘要 為闡明哈維氏弧菌對(duì)青石斑幼魚(yú)的致病特性，開(kāi)展了人工感染試驗(yàn)，注射感染健康青石斑幼魚(yú)14 d，其半致死劑量（LD50）為6×105 CFU/mL。毒力基因分析表明，該菌株攜帶鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaB、flaC，溶血素基因vhhA、vhhB，群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因luxR和幾丁質(zhì)酶基因chiA 6個(gè)毒力基因。耐藥性分析表明，菌株TJYG-42對(duì)甲硝唑（MTZ）、鏈霉素（S）、阿莫西林（AMX）和氨芐西林（AM） 4種藥物具有抗性。組織病理學(xué)分析表明，菌株TJYG-420感染引起了魚(yú)體組織明顯的病理變化，包括皮膚組織中囊狀細(xì)胞數(shù)量明顯增加，鰓細(xì)胞增生、腫脹、毛細(xì)血管擴(kuò)張，腸黏膜斷裂破損，部分絨毛脫落，肝臟細(xì)胞空泡化等。這些研究結(jié)果將為養(yǎng)殖青石斑魚(yú)細(xì)菌性疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 青石斑魚(yú)；哈維氏弧菌；耐藥性；毒力基因；組織病理學(xué)評(píng)估

中圖分類(lèi)號(hào) S 941? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2023）12-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.020

Identification and Pathogenicity Analysis of Vibrio harveyi from Juvenile Yellow Grouper （Epinephelus awoara）

GUO Mei-ling，PANG Yue，LIU Xin-rui et al

（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract In order to elucidate the pathogenic characteristics of the V.harveyi isolate on juvenile yellow grouper，we conducted artificial infection experiments using intraperitoneal injection and the LD50 was determined as 6×105 CFU/mL in 14 days.The virulence gene analysis showed that the V.harveyi isolate carried 6 virulence genes，including flagellin （flaB、flaC），protease （chiA），hemolysin （vhhA、vhhB），population sensing system （luxR）.Antibiotic susceptibility analysis showed that the V.harveyi isolate was susceptible to most antibiotics and resistant to only four drugs，including metronidazole（MTZ），streptomycin（S），amoxicillin（AMX） and ampicillin（AM）.Histopathological analysis showed that the infection of the V.harveyi isolate caused obvious pathological changes in fish tissues，including more sacciform cells which cytoplasmic content formed an eosinophilic clump in the centre presented in skin tissues; cellular swelling vacuolation inflammatory infiltrating and angiotelectasis in gill lamellae; blunted，fused or shed intestinal villi and loosened mucous layer and connective tissues in intestine; cellular vacuolation in liver.The results suggest that the V.harveyi isolate is the causative pathogen causing massive mortalities in juvenile yellow grouper，carries a high number of virulence genes，is susceptible to most antibiotics，and its infection caused severe histopathological changes in the fish.These results of these studies will provide technical supports for the control of bacterial diseases in cultured yellow grouper.

Key words Vibrio harveyi;Epinephelus awoara;Drug resistance;Virulence genes;Histopathological analysis

基金項(xiàng)目 天津市海水養(yǎng)殖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ITTMR-S2022006）；天津市勞模創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 郭美玲（1996—），女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)病害學(xué)。*通信作者，研究員，從事水產(chǎn)病害學(xué)研究。

收稿日期 2023-01-05

青石斑（Epinephelus awoara）是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，養(yǎng)殖青石斑疾病頻發(fā)，給養(yǎng)殖企業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。弧菌是海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的主要致病病原，隸屬于弧菌科弧菌屬，常見(jiàn)于海水中。近年來(lái)，弧菌引起的魚(yú)類(lèi)疾病越來(lái)越多。據(jù)報(bào)道，多種弧菌可以感染海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，如副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）［1］、擬態(tài)弧菌（V.mimicus）［2］、哈維氏弧菌（V.harveyi）［3］、溶藻弧菌（V.anguillarum）［4］等。近年來(lái)，關(guān)于哈維氏弧菌感染海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的研究報(bào)道較多。哈維氏弧菌（vibrio harveyi）是一種海洋革蘭氏陰性發(fā)光微生物，生活在河口和海洋棲息地，需要氯化鈉［5］。該細(xì)菌是養(yǎng)殖水生魚(yú)類(lèi)的一種重要病原體，可以感染多種水生魚(yú)類(lèi)?；疾◆~(yú)體的常見(jiàn)臨床癥狀包括皮膚潰瘍、鱗片脫落、肌肉壞死和鰓蓋上的結(jié)節(jié)等。研究表明，不同分離株的哈維氏弧菌，其致病特性存在差異。筆者對(duì)哈維氏弧菌的新分離株進(jìn)行了致病性研究，將為闡釋哈維氏弧菌的流行及為養(yǎng)殖青石斑細(xì)菌性疾病的預(yù)防和控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 青石斑幼魚(yú)購(gòu)自天津某海水工廠化養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)8～12 cm，養(yǎng)殖水溫（22±1）℃，鹽度（25‰～26‰）。

1.2 人工感染試驗(yàn)

健康青石斑幼魚(yú)在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為7組，6組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，每組10尾魚(yú)。采用腹腔注射的方式，試驗(yàn)組注射不同濃度梯度（4.7×107、4.7×106、4.7×105、4.7×104、4.7×103、4.7×102 CFU/mL）的TJYG-420菌懸液，注射劑量0.1 mL/尾。對(duì)照組注射同劑量0.7 % NaCl溶液。觀察并記錄魚(yú)體發(fā)病癥狀及死亡情況。取瀕死青石斑幼魚(yú)的體表、肝臟、脾臟、腎臟等器官組織，再次分離純化細(xì)菌，并進(jìn)行鑒定。按照寇氏法計(jì)算病原菌對(duì)青石斑幼魚(yú)的半致死劑量（LD50）。

1.3 菌株TJYG-420的鑒定

1.3.1 生理生化特性。

采用弧菌科和腸桿菌科生化鑒定管（購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司）測(cè)定細(xì)菌的生理生化特征。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［6］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［7］生化指標(biāo)分析菌株特征。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定。

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自天根生化科技有限公司）的方法提取DNA作為模板。引物（表1）由生物工程（北京）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：20 mmol/L正反向引物4 μL，2×Taq MasterMix酶（購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司）25 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s、55 ℃，30 s、72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。測(cè)序結(jié)果利用MEGA11軟件采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 毒力基因檢測(cè) 試驗(yàn)選取了11種毒力基因，包括鞭毛蛋白（flaA、flaB、flaC）、溶血素（vhhA、vhhB、hlyA）、毒力調(diào)控基因（toxS、toxR）、鋅金屬蛋白酶（pap6）、群體效應(yīng)調(diào)節(jié)基因（luxR）、幾丁質(zhì)酶基因（chiA）。PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序：94 ℃，3 min，94 ℃，30 s、58 ℃，30 s、72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。根據(jù)Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，其序列見(jiàn)表1。

1.5 耐藥性分析

試驗(yàn)選取29種藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）測(cè)定細(xì)菌對(duì)各種抗菌藥物的敏感性［10］。

1.6 組織病理分析

分別取健康和注射感染菌株TJYG-420 12 h青石斑幼魚(yú)的皮膚、鰓絲、腸道和肝臟組織，用4%多聚甲醛溶液固定液固定，組織切片制備等參照文獻(xiàn)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工感染 在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組魚(yú)活動(dòng)及進(jìn)食正常，無(wú)發(fā)病或死亡情況出現(xiàn)。注射高濃度菌液組的魚(yú)體死亡率為100%，而其他組的死亡率分別為30%、10%和0，經(jīng)計(jì)算LD50為6×105 CFU/mL。從發(fā)病魚(yú)體內(nèi)臟中分離獲得優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)鑒定為哈維氏弧菌。

2.2 生理生化鑒定

菌株TJYG-420的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。菌株TJYG-420能利用葡萄糖、蔗糖和甘露糖，發(fā)酵產(chǎn)氣，分解尿素，能在3%～6% NaCl中生長(zhǎng)，而在8%～10% NaCl不生長(zhǎng)。經(jīng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其生理生化特征與哈維氏弧菌基本保持一致，初步判定為哈維氏弧菌。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)16S rRNA基因和hsp60基因分別擴(kuò)增得到大小約1 500 bp和532 bp的片段。將菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列在NCBI上進(jìn)行同源性檢索并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示（圖1），菌株TJYG-420與哈維氏弧菌聚為一支，進(jìn)一步確定TJYG-420菌株為哈維氏弧菌。

2.4 毒力基因分析

11種毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），菌株TJYG-420攜帶flaB、flaC、vhhA、vhhB、chiA和luxR 6個(gè)毒力基因。

2.5 耐藥性分析

耐藥性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，在抗菌藥物中，菌株TJYG-420對(duì)阿奇霉素（AZM）、氯霉素（C）、奈替米星（NET）、哌拉西林（PIP）、慶大霉素（GM）、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)以及頭孢類(lèi)等藥物表現(xiàn)敏感，對(duì)甲硝唑（MTZ）、鏈霉素（S）、阿莫西林（AMX）和氨芐西林（AM） 4種藥物呈耐藥性。

2.6 組織病理分析

從圖3可以看出，與健康魚(yú)相比，感染魚(yú)表現(xiàn)出明顯的病理?yè)p傷?；疾∮佐~(yú)皮膚囊狀細(xì)胞增多，其細(xì)胞質(zhì)成分在中心形成一個(gè)嗜酸性團(tuán)塊，與細(xì)胞膜分離，而杯狀細(xì)胞在健康魚(yú)體較多；病魚(yú)鰓小片上皮細(xì)胞增生、腫脹、肥大，部分鰓細(xì)胞空泡變性，毛細(xì)血管擴(kuò)張；腸黏膜固有層零星，黏膜斷裂破損，部分絨毛脫落，黏膜層和結(jié)締組織松動(dòng)；肝細(xì)胞空泡變性，局部壞死。

3 討論

生理生化特性分析是細(xì)菌鑒定的經(jīng)典方法，但是該方法很難區(qū)分同一科屬的不同種細(xì)菌，且試驗(yàn)流程煩瑣，結(jié)果判定有一定的主觀性。近年來(lái)，分子鑒定在細(xì)菌的分類(lèi)鑒定中發(fā)揮了重要作用。16S rRNA基因是細(xì)菌鑒定中最常用的分子靶標(biāo)［12］，但是16S rRNA基因高度保守，對(duì)于同一屬內(nèi)的不同種難以很好地區(qū)分。研究表明，hsp60基因是一個(gè)編碼60 kDa熱休克蛋白的保守基因，其在同一屬的不同種之間表現(xiàn)出高度的序列多樣性［13］。因此，hsp60基因可用于快速、直接地從臨床標(biāo)本中鑒定致病性弧菌物種。筆者擴(kuò)增了菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列，Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，菌株TJYG-420的16S rRNA和hsp60基因序列與V.harveyi菌株的相似性最高。

哈維氏弧菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要病原，其自身攜帶的毒力基因與其致病性密切相關(guān)。該研究對(duì)青石斑魚(yú)致病過(guò)程起重要作用的毒力因子進(jìn)行了研究。Yang等［14］從患病大黃魚(yú)中分離出的哈維氏弧菌中攜帶 chiA、vhh毒力基因；吳立婷等［15］研究表明，寧德地區(qū)54株哈維氏弧菌均攜帶toxR、vhhA、vhhB、luxR 4個(gè)毒力基因；Peeralil等［16］研究表明，哈維氏弧菌毒力基因主要分為6種基因型，以vhpA、flaB、ser、vhh、luxR、vopD、vcrD、vscN為主；有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示［3，17］，分離的哈維氏弧菌中vhh、luxR、chiA和toxR含量高于70%。分析結(jié)果顯示，菌株TJYG-420攜帶包括鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaB、flaC，溶血素基因vhhA、vhhB，群體效應(yīng)基因luxR和幾丁質(zhì)酶基因chiA 6個(gè)毒力基因。以上研究表明，哈維氏弧菌不同分離株之間攜帶的毒力基因存在差異，這也解釋了哈維氏弧菌的不同分離株，其致病性存在較大的差異。

抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于治療、控制和預(yù)防細(xì)菌性疾病，被視為水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐中疾病管理的工具之一。不同來(lái)源地區(qū)、不同宿主的哈維氏弧菌株耐藥譜型存在差異。Shen等［18］研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌對(duì)17種抗生素耐藥，僅對(duì)頭孢曲松、強(qiáng)力霉素和米諾環(huán)素3種抗生素敏感。Deng等［19］從中國(guó)患病龍膽石斑魚(yú)中分離的哈維氏弧菌對(duì)氨芐西林、利福平、四環(huán)素等13種抗生素表現(xiàn)出耐藥性。該研究結(jié)果顯示，菌株TJYG-420僅對(duì)氨芐西林、阿莫西林、鏈霉素、甲硝唑4種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，與上述研究結(jié)果存在較大差異。這可能是由于菌株宿主、來(lái)源以及養(yǎng)殖過(guò)程中抗菌藥使用情況存在差異所致。目前，施用化學(xué)藥物仍是控制養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病的重要手段之一。鑒于不同分離株的哈維氏弧菌的耐藥性存在較大差異，對(duì)哈維氏弧菌的新分離株進(jìn)行耐藥特性分析，可為精準(zhǔn)防控由哈維氏弧菌引起的疾病提供直接的用藥參考。同時(shí)，為明確海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)弧菌病原耐藥現(xiàn)狀分析提供可靠的參考依據(jù)。

魚(yú)類(lèi)的第一道防線是由皮膚、鰓和腸道［20］等黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）組成。該研究中，感染菌株TJYG-420的石斑魚(yú)皮膚中囊狀細(xì)胞明顯增加，這種變化與Mohamad等［21］研究研究結(jié)果一致。囊狀細(xì)胞位于表皮的表層，在表皮損傷時(shí)釋放其內(nèi)容物導(dǎo)致酸性物質(zhì)增多，顏色加深。這些細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)以信息素、毒素形式存在，并被認(rèn)為是由血清素介導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn)囊狀細(xì)胞還產(chǎn)生和分泌凝集素，凝集素可作為模式識(shí)別受體［22］。因此，囊狀細(xì)胞被認(rèn)為與魚(yú)類(lèi)免疫有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道，在活躍的寄生蟲(chóng)感染期間，它們?cè)隰~(yú)類(lèi)皮膚中的數(shù)量顯著增加了40倍［23-24］。哈維氏弧菌感染后，鰓小片上皮細(xì)胞表現(xiàn)為增生、腫脹、肥大，部分鰓細(xì)胞空泡變性，毛細(xì)血管擴(kuò)張，這與許悅［25］的部分研究結(jié)果一致。腸道組織形態(tài)與其功能相適應(yīng)，其差異主要表現(xiàn)在黏膜層，其中黏膜褶皺的高低和疏密、上皮細(xì)胞的完整性和數(shù)量等方面影響了腸道性能［26］。哈維氏弧菌感染后，腸道黏膜褶皺形態(tài)發(fā)生皺縮或損傷直至脫落，這與Zhang等［2］研究發(fā)現(xiàn)擬態(tài)弧菌感染黃顙魚(yú)造成腸絨毛嚴(yán)重的變性和壞死脫落是一致的。而陳成等［27］病理結(jié)果顯示，腸絨毛黏膜層僅表現(xiàn)為水腫變性。由于肝臟的造血功能，貧血引起的代償性水腫可能會(huì)增加肝血管的通透性，增加肝組織中紅細(xì)胞的浸潤(rùn)量［28］，這些病理?yè)p傷上的差異都暗示了不同菌株有著不同的致病機(jī)制。綜上所述，筆者推斷病原體的復(fù)雜病理過(guò)程導(dǎo)致了一系列感染水平的發(fā)生，并推測(cè)是這些病變導(dǎo)致了患病魚(yú)體多個(gè)組織器官的功能受損，進(jìn)而使魚(yú)體逐漸喪失了正常的生理代謝功能，最終導(dǎo)致了其發(fā)病和死亡。

參考文獻(xiàn)

［1］ LIU L，GE M F，ZHENG X Y，et al.Investigation of Vibrio alginolyticus，V.harveyi，and V.parahaemolyticus in large yellow croaker，Pseudosciaena crocea （Richardson） reared in Xiangshan Bay，China［J］.Aquaculture reports，2016，3：220-224.

［2］ ZHANG X，LI Y W，MO Z Q，et al.Outbreak of a novel disease associated with Vibriomimicus infection in fresh water cultured yellow catfish，Pelteobagrus fulvidraco［J］.Aquaculture，2014，432：119-124.

［3］ ZHU Z M，DONG C F，WENG S P，et al.The high prevalence of pathogenic Vibrio harveyi with multiple antibiotic resistance in scale drop and muscle necrosis disease of the hybrid grouper，Epinephelus fuscoguttatus （♀）×E.lanceolatus （♂），in China［J］.Journal of fish diseases，2018，41（4）：589-601.

［4］ 李卓昱，鮑玉杰，尚玉曼，等.一株溶藻弧菌H1B6的分離與鑒定［J］ .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（5）：100-103，146.

［5］ AUSTIN B，ZHANG X H.Vibrio harveyi：A significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates［J］.Letters in applied microbiology，2006，43（2）：119-124.

［6］ BERGEY D H，HOLT J G.Bergeys manual of determinative bacteriology［M］.9th ed.Baltimore：Williams & Wilkins，1994.

［7］ 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［8］ STACKEBRANDT E，GOODFELLOW M.Nucleic acid techniques in bacterial systematics［M］.Chichester：Wiley，1991.

［9］ WONG R S Y，CHOW A W.Identification of enteric pathogens by heat shock protein 60 kDa （HSP60） gene sequences［J］.FEMS microbiology letters，2002，206（1）：107-113.

［10］ 曾德乾，馮娟，徐力文，等.海水養(yǎng)殖魚(yú)哈維弧菌分離株的耐藥譜型分析［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2015，22（1）：129-138.

［11］ 王印庚，楊洋，張正，等．津冀地區(qū)養(yǎng)殖三疣梭子蟹大量死亡的病原和病理分析［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2017，24（3）：596-605.

［12］ BUSSE H J，DENNER E B M，LUBITZ W.Classification and identification of bacteria：Current approaches to an old problem.Overview of methods used in bacterial systematics［J］.Journal of biotechnology，1996，47（1）：3-38.

［13］ GOH S H，POTTER S，WOOD J O，et al.HSP60 gene sequences as universal targets formicrobial species identification：Studies with coagulase-negative staphylococci［J］.Journal of clinical microbiology，1996，34（4）：818-823.

［14］ YANG A M，LI W Y，TAO Z，et al.Vibrio harveyi isolated from marine aquaculture species in eastern China and virulence to the large yellow croaker （Larimichthys crocea）［J］.Journal of applied microbiology，2021，131（4）：1710-1721.

［15］ 吳立婷，廖金軒，龐茂達(dá)，等.大黃魚(yú)中哈維氏弧菌毒力及耐藥特性分析［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（8）：2111-2119.

［16］ PEERALIL S，JOSEPH T C，MURUGADAS V，et al.Vibrio harveyi virulence gene expression in vitro and in vivo during infection in black tiger shrimp Penaeus monodon［J］.Diseases of aquatic organisms，2020，139：153-160.

［17］ BLUFORD J，GAUTHIER D，COLASANTO M，et al.Identification of virulence genes in Vibrio spp.isolates from the 2009 Bermuda reef fish mortality event［J］.Journal of fish diseases，2017，40（4）：597-600.

［18］ SHEN G M，SHI C Y，F(xiàn)AN C，et al.Isolation，identification and pathogenicity of Vibrio harveyi，the causal agent of skin ulcer disease in juvenile hybrid groupers Epinephelus fuscoguttatus× Epinephelus lanceolatus［J］.Journal of fish diseases，2017，40（10）：1351-1362.

［19］ DENG Y Q，XU H D，SU Y L，et al.Horizontal gene transfer contributes to virulence and antibiotic resistance of Vibrio harveyi 345 based on complete genome sequence analysis［J］.BMC genomics，2019，20（1）：1-19.

［20］ CHIENG C C Y，DAUD H M，YUSOFF F M，et al.Mucosal responses of brown-marbled grouper Epinephelus fuscoguttatus （Forsskl，1775） following intraperitoneal infection with Vibrio harveyi［J］.Journal of fish diseases，2020，43（10）：1249-1258.

［21］ MOHAMAD N，MOHD ROSELI F A，AZMAI M N A，et al.Natural concurrent infection of Vibrio harveyi and V.alginolyticus in cultured hybrid groupers in Malaysia［J］.Journal of aquatic animal health，2019，31（1）：88-96.

［22］ TSUTSUI S，SUZUKI Y，SHIBUYA K，et al.Sacciform cells in the epidermis of fugu （Takifugu rubripes） produce and secrete kalliklectin，a novel lectin found in teleosts［J］.Fish & shellfish immunology，2018，80：311-318.

［23］ CHIVERS D P，WISENDEN B D，HINDMAN C J，et al.Epidermal ‘a(chǎn)larm substancecells of fishes maintained by non-alarm functions：Possible defence against pathogens，parasites and UVB radiation［J］.Proceedings of the royal society B，2007，274（1625）：2611-2619.

［24］ PICKERING A D，F(xiàn)LETCHER J M.Sacciform cells in the epidermis of the brown trout，Salmo trutta，and the Arctic char，Salvetinus alpinus［J］.Cell and tissue research，1987，247（2）：259-265.

［25］ 許悅.海南地區(qū)養(yǎng)殖石斑魚(yú)兩種細(xì)菌性疾病病原病理學(xué)研究［D］.海口：海南大學(xué)，2018.

［26］ 夏青，王寶杰，劉梅，等.哈維氏弧菌浸浴后凡納濱對(duì)蝦腸道組織病理變化及轉(zhuǎn)錄水平的免疫應(yīng)答［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2015，39（10）：1521-1529.

［27］ 陳成，耿毅，汪開(kāi)毓，等.擬態(tài)弧菌感染黃顙魚(yú)的動(dòng)態(tài)病理?yè)p傷及病原分布研究［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2017，13（1）：10-18.

［28］ MUSSO G，CASSADER M，PASCHETTA E，et al.Thiazolidinediones and advanced liver fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis：A meta-analysis［J］.JAMA internal medicine，2017，177（5）：633-640.