楊福華 劉韶娜 廖雋銳 常雅潔 李新榮 霍金龍 趙智勇

（1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224）

近年來，隨著畜牧產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，牛羊養(yǎng)殖集約化、規(guī)模化模式日趨壯大，對飼料的需求量不斷增加[1]。常規(guī)飼料已無法滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)需要，因此對非常規(guī)飼料進行開發(fā)尤為重要[2-3]。青貯飼料是畜禽生產(chǎn)的重要飼料來源之一，青貯發(fā)酵可以抑制有害菌生長[4]，延長飼料的存放時間，保留飼料的營養(yǎng)價值，解決飼料供給不足問題[5]。青貯劑能夠改善飼料營養(yǎng)狀況，降低纖維含量，增加適口性，是非常規(guī)飼料的首選制作方法[6]。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類生物多樣性廣、抗逆性強且安全無害的有益菌群。芽孢桿菌可快速營造厭氧環(huán)境[7]，產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制病原菌的生長繁殖[8]。芽孢桿菌處理后的飼料，中性洗滌纖維（NDF）和淀粉的消化率有所提高[9]。目前，芽孢桿菌制劑已在飼料發(fā)酵等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力。有研究表明，添加枯草芽孢桿菌能夠降低飼料的pH值和氨態(tài)氮含量[10-11]。

蠶豆秸稈質(zhì)地硬、適口性差，若作為粗飼料的來源，利用時間短且利用率低[12-13]。但蠶豆秸稈能夠改善母豬繁殖性能[14]，增加奶牛產(chǎn)奶量[15]，提高山羊生產(chǎn)性能[13]。為充分合理利用蠶豆秸稈資源，提高蠶豆副產(chǎn)品效益，本研究將分離純化后的芽孢桿菌經(jīng)特性研究鑒定后接種到蠶豆稈中發(fā)酵，以青貯飼料感官評價和營養(yǎng)成分變化確定芽孢桿菌對蠶豆秸稈青貯品質(zhì)的影響，為蠶豆秸稈的高效利用及青貯品質(zhì)的提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

菌株樣品分離自半散養(yǎng)條件下5 頭地方豬的新鮮豬糞混合物；蠶豆秸稈來自云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院種植園。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、葡萄糖1.0 g、酵母膏粉5.0 g，調(diào)節(jié)pH 值至6.8～7.2 范圍內(nèi)，超純水定容至1 L，121 ℃條件下滅菌20 min。

LB 瓊脂培養(yǎng)基：配方同LB 液體培養(yǎng)基，添加瓊脂粉20 g/L。

營養(yǎng)（NA）肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g，121℃條件下滅菌20 min。

營養(yǎng)（NA）瓊脂培養(yǎng)基：配方同營養(yǎng)（NA）肉湯培養(yǎng)基，添加瓊脂粉20 g/L。

1.1.3 試劑與儀器

卡那霉素（k30）、慶大霉素（cn10）、青霉素（p10）購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

SX-500 高壓蒸汽滅菌器（TOMY-KOGYOCO.LTD）、SW-CJ1FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、PHS-3C pH計（雷磁，上海儀電科學(xué)儀器有限公司）、CCH-HIGHPOINT20實驗室超純水機（湖南創(chuàng)純水處理設(shè)備有限公司）、ZQLY-180GV 振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、UV-9000S 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）、1000 型高速多功能粉碎機（武義海納電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離純化

取半散養(yǎng)條件下的5 頭地方育肥豬的新鮮豬糞的混合樣品5 g，置于250 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)24 h，80 ℃水浴20 min，使用0.9%的生理鹽水做梯度稀釋后選擇10-5倍稀釋液，用接種環(huán)將菌液上清液接種于LB 瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別挑取具有典型芽孢桿菌形態(tài)的單菌落到LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。反復(fù)挑斑，經(jīng)過4 代篩選后篩選到菌落形態(tài)一致的單菌落，于30%的甘油中-20 ℃保存。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色

將復(fù)篩獲得的菌株利用接種棒劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落的隆起形狀、透明度、顏色、質(zhì)地、邊緣等，挑取少許單菌落進行革蘭氏染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

使用試劑盒提取總DNA作為模板，采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 進行PCR 擴增。電泳檢測PCR 產(chǎn)物，大小約1.5 kb，產(chǎn)物交到擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果提交GenBank 進行Blast比對分析，并選取同屬內(nèi)近緣種的16S rRNA基因序列，采用MEGA 11.0軟件和利用MegAlign分析氨基酸序列同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 生長曲線及產(chǎn)酸特性

將篩選的芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基中活化（30 ℃、100 r/min過夜）。另配制LB液體培養(yǎng)基并分裝于100 mL錐形瓶，每個錐形瓶中接種預(yù)先過夜培養(yǎng)的菌液100 μL，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 快速吸取每種菌液5 mL 測定pH 值和OD600nm吸光度值。統(tǒng)計測量結(jié)果并繪制芽孢桿菌生長曲線和pH值變化曲線。

1.2.5 抗生素的耐藥性

采用藥敏紙片擴散法檢測芽孢桿菌對3 種抗生素的耐藥性。以1%接種量將測試菌株菌液接入50 ℃左右的經(jīng)高壓蒸汽滅菌的LB瓊脂固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒入平板中。將含有定量抗生素[卡那霉素（k30）、慶大霉素（cn10）、青霉素（p10）]的濾紙片貼在已接種了測試菌的LB瓊脂培養(yǎng)基表面，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的大小。根據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[16]判斷細菌對抗生素的敏感性效果。抑菌圈直徑小于10 mm，不敏感；直徑10～15 mm，中度敏感；直徑大于15 mm，敏感[17]。

1.2.6 菌株對蠶豆稈青貯發(fā)酵的影響

收割采摘蠶豆后的蠶豆秸稈，含水率為75.17%，用微型粉碎機將蠶豆秸稈的粉碎長度為5～10 mm，按1∶0.4的比例與米糠混勻。試驗組添加試驗菌株YF-15，添加量為106CFU/g，對照組加入同等體積的無菌水，混勻后每袋1 000 g樣品裝入發(fā)酵袋，壓緊，排出空氣，密封，放在室外避光發(fā)酵。30 d 后進行常規(guī)成分分析和青貯飼料質(zhì)量的評定。參照《食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）[18]測定灰分（Ash）含量，參照《食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）[19]測定粗蛋白（CP）含量，參照《食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）[20]測定粗脂肪（EE）的含量，按國標(biāo)方法檢測水分、粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量，青貯飼料質(zhì)量評定參照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（DLG）評分標(biāo)準(zhǔn)，對氣味、結(jié)構(gòu)、色澤進行評分，分為優(yōu)、上、中、下等[21]。評分細則見表1。實驗室測定指標(biāo)包括青貯飼料的pH 值和營養(yǎng)成分，以表1判斷青貯飼料發(fā)酵情況[22]。

表1 DLG推薦的青貯飼料質(zhì)量感官評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果

從半散養(yǎng)地方豬育肥豬的新鮮豬糞中篩選得到一株有孢子、革蘭氏染色呈陽性的芽孢桿菌，菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見圖1。由圖1 可知，菌株在LB 固體培養(yǎng)基上單菌落呈圓形，表面光滑，邊緣規(guī)則，顏色為灰白色；經(jīng)過革蘭氏染色后，表現(xiàn)為革蘭氏陽性、桿狀、單一或串生、有芽孢，分離菌株命名為YF-15。

圖1 分離株形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果

2.2 菌株YF-15的分子鑒定結(jié)果

根據(jù)北京擎科生物科技有限公司（昆明）測定的DNA 序列，獲得1 405 bp 的序列長度，將測序結(jié)果提交GenBank獲得登錄號為OP349652，通過Blast序列比對以及利用MegAlign進行序列同源性比對，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株的同源性比對

由圖2 可知，芽孢桿菌YF-15 與阿氏芽孢桿菌（MT525305.1）的相似性達到了96%；與阿氏芽孢桿菌（MT538470.1）、清生芽孢桿菌（MT353876.1）、巨大芽孢桿菌（MT279338.1）、巨型芽孢桿菌（MH127618.1）、惠州芽孢桿菌（MK618613.1）、蒼白桿菌（KU877680.1）相似性達到了98%。

菌株YF-15的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株YF-15和巨型阿氏芽孢桿菌（MH748616.1）在同一分支，提示兩者的親緣關(guān)系較近。

圖3 菌株YF-15的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株YF-15的生長曲線和pH值變化曲線（見圖4）

圖4 菌株YF-15的生長曲線和pH值變化曲線

由圖4（a）可知，菌株YF-15 在30 ℃的LB 液體培養(yǎng)基中能夠正常生長且可達到較高的濃度，培養(yǎng)到2 h快速生長，4 h 時后生長逐漸減慢，14 h 后生長逐漸平緩，進入穩(wěn)定期，20 h后進入穩(wěn)定后期。

由圖4（b）可知，菌株YF-15 菌液的pH 值在2～4 h內(nèi)快速降低，4 h后逐漸上升，表明芽孢桿菌的生長消耗了培養(yǎng)液中的酸性營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)至16 h時，菌液pH值變化趨于平緩，但隨著菌株生長，消耗了菌液中的酸性物質(zhì)，pH值持續(xù)升高。

2.4 菌株YF-15對抗生素的耐藥性（見表2）

表2 菌株YF-15對抗生素的耐藥性

由表2 可知，菌株YF-15 對青霉素（p10）不敏感，對卡那霉素（k30）和慶大霉素（cn10）為中度敏感。

2.5 菌株YF-15對蠶豆秸稈青貯的感官及營養(yǎng)成分的影響（見表3、表4）

表3 菌株YF-15對蠶豆秸稈青貯感官評價的影響

表4 菌株YF-15對蠶豆青貯飼料常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響 單位：%

由表3、表4可知，試驗組蠶豆秸稈青貯的氣味評分和pH 值均優(yōu)于對照組，CP、EE 含量均高于對照組，DM、Ash、CF、ADF和NDF含量均低于對照組。

3 討論

3.1 芽孢桿菌的生物特性分析

芽孢桿菌廣泛存在于土壤、動物腸道、植物體、空氣以及水體等環(huán)境中，是動物腸道內(nèi)的主要菌群之一。芽孢桿菌具有抗逆性強、營養(yǎng)要求低、繁殖速度快、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[23]，具有改善動物胃腸道的功能，可增強動物免疫力，提高動物生產(chǎn)性能[24-25]。

本研究從半散養(yǎng)育肥豬的新鮮豬糞中篩選分離到一株芽孢桿菌，經(jīng)常規(guī)特征觀察、革蘭氏染色以及生長趨勢、產(chǎn)酸性能、抗生素耐受性分析，并經(jīng)16S rDNA測序后鑒定得到菌株的序列信息，將測序結(jié)果提交GenBank獲得的登錄號OP349652。該芽孢桿菌YF-15 能夠在LB瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，主要包括遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期，在測定的24 h內(nèi)未出現(xiàn)衰亡期；菌株在2 h時開始快速生長，4 h 后生長逐漸平緩，進入穩(wěn)定期。夏超篤等[26]研究了一株解淀粉芽孢桿菌的生長規(guī)律，發(fā)現(xiàn)菌株在4～6 h 后進入對數(shù)生長期，12 h 后進入穩(wěn)定期。王君等[27]研究了一株地衣芽孢桿菌生長規(guī)律，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4 h后菌株生長進入對數(shù)期，此時活菌數(shù)開始迅速上升，在第12 h 進入穩(wěn)定期。本研究結(jié)果顯示，芽孢桿菌YF-15 菌液的pH 值可維持在7.0 左右，且隨著菌株生長pH 值在5.5～7.5 范圍內(nèi)變化。劉軍生等[28]對一株阿氏芽孢桿菌的產(chǎn)酸試驗結(jié)果表明，菌株生長最適pH 值約7.0，在6.0～7.5范圍內(nèi)生長良好，無法在強酸或強堿的環(huán)境中生長。

本研究通過Blast 序列比對分析了多菌株序列同源性，并構(gòu)建了進化樹，菌株YF-15 與其他芽孢桿菌的相似度均在98%以上。進化分析結(jié)果表明，菌株YF-15 和MT748616.1Priestiaaryabhattai在同一分支，提示芽孢桿菌YF-15 與該菌株的親緣關(guān)系較近?？股啬軌驓⑺烂舾械挠幸婢?，留下耐藥菌株。這些菌株的數(shù)量會隨著時間的推移而增加，并可能成為耐藥菌株。為使有益菌發(fā)揮最大的作用，在使用有益菌時應(yīng)避免與其敏感的抗生素一同使用[29]。菌株YF-15 的抗生素耐藥性試驗結(jié)果表明，該菌株對青霉素（p10）不敏感，對卡那霉素（k30）和慶大霉素（cn10）為中度敏感。菌株YF-15 對所試驗抗生素的耐藥性表現(xiàn)優(yōu)于前人研究，表明芽孢桿菌YF-15可在含有一定量抗生素的環(huán)境中生長[17,30-31]。

3.2 芽孢桿菌作為青貯添加劑對蠶豆青貯發(fā)酵效果的影響

將從新鮮豬糞中分離的芽孢桿菌YF-15 添加到蠶豆秸稈青貯飼料后，青貯飼料的氣味評分和pH值評分均優(yōu)于對照組，常規(guī)成分檢測發(fā)現(xiàn)飼料的EE、CP等含量高于對照組，并且CF 含量顯著降低。試驗組的ADF 和NDF較對照組分別降低了18.81%和7.68%，說明芽孢桿菌YF-15 對CF 具有較強的降解能力，并且還具有提高EE和CP 含量的能力，可使飼料營養(yǎng)物質(zhì)得到較好的保存。產(chǎn)生這些變化的原因可能是因為青貯飼料在發(fā)酵過程中，芽孢桿菌的生長、發(fā)酵影響了蠶豆的細胞壁結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)容物大量流出，與微生物進行各種反應(yīng)，從而導(dǎo)致色澤、氣味、質(zhì)地和pH值等發(fā)生了變化。有研究表明，添加青貯添加劑對青貯飼料的色澤、氣味、質(zhì)地和pH值有所改變[32]。青貯飼料的原料中含有大量的微生物，而有害微生物是造成飼料中營養(yǎng)成分減少的主要原因之一。在青貯發(fā)酵過程中添加有益菌可抑制有害菌的生長，從而降低飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵桑葉可降低飼料CF 和EE含量，提高CP含量，與本研究結(jié)果相似[34-36]。有研究表明，NDF和ADF含量越高，飼料品質(zhì)越差。有研究對蠶豆秸稈的洗滌纖維含量進行分析，發(fā)現(xiàn)NDF和ADF含量達到了55.08%和63.04%[37]。本試驗中添加了米糠，導(dǎo)致NDF和ADF含量較高。也有研究表明，蠶豆秸稈對綿羊生長的NDF和ADF均無顯著影響[38]。

4 結(jié)論

本研究從新鮮豬糞中篩選分離得到一株芽孢桿菌（Bacillus），命名為BacillusYF-15。對BacillusYF-15 的特性研究發(fā)現(xiàn)，該篩選菌株具有較好的生長性，對常見的抗生素具有一定的耐藥性。將菌株YF-15 作為微生物添加劑對蠶豆秸稈發(fā)酵，能夠提高蠶豆秸稈青貯飼料的CP、EE 的含量，降低DM、Ash、CF、ADF 和NDF 含量，提高感官評價水平。