孫 宇 楊燕燕 吳春會 祖曉偉 王明亞 李秋鳳

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2．河北省畜牧總站，河北 石家莊 050000）

紫花苜蓿是奶牛的優(yōu)質(zhì)飼草，但受雨季影響，苜蓿干草調(diào)制受到制約[1]，因此可以對紫花苜蓿進(jìn)行青貯保存。但苜蓿中水溶性碳水化合物不足，緩沖能力高，附生乳酸菌數(shù)量少，青貯苜蓿的條件并不理想[2]。在青貯飼料中添加微生物可保證青貯飼料的優(yōu)良品質(zhì)。許多研究使用布氏乳桿菌和一些有機(jī)酸提高青貯品質(zhì)，枯草芽孢桿菌也被用作微生物青貯飼料添加劑，以抑制好氧腐敗并增加青貯飼料的體外消化[3]。

枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生纖維素酶，這些酶可通過水解植物細(xì)胞壁增加可溶性糖的釋放，從而提高乳酸生產(chǎn)速率[4]?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的多肽和抗真菌化合物可以抑制酵母和絲狀真菌等不良微生物生長，防止青貯飼料變質(zhì)和真菌毒素產(chǎn)生[5]。因此，枯草芽孢桿菌被認(rèn)為是一種有效的青貯飼料添加劑。Gandra 等[6]研究表明，添加枯草芽孢桿菌能夠顯著增加青貯甘蔗中乙酸的含量，同時降低丁酸含量。李立波等[7]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可顯著降低玉米秸稈中木質(zhì)纖維素，提高蛋白質(zhì)含量，從而改善玉米秸稈的營養(yǎng)品質(zhì)。在青貯過程中，添加酶制劑也有利于發(fā)酵，酶可將植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖降解為單糖，為乳酸菌提供發(fā)酵底物，加速發(fā)酵，達(dá)到抑制梭酸菌發(fā)酵的目的。復(fù)合酶制劑含有多種酶，對青貯可能有一定的促進(jìn)效用。本試驗(yàn)擬在苜蓿青貯中添加不同濃度的枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑，對其發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行測定分析，旨在篩選出適合苜蓿青貯的添加量，提高青貯品質(zhì)，為畜牧生產(chǎn)中苜蓿青貯技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿：中苜2 號，現(xiàn)蕾期，第一茬，晾曬至水分含量55%，留茬高度7～8 cm，鍘短長度為2～3 cm。紫花苜蓿營養(yǎng)成分見表1。

表1 紫花苜蓿營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)） 單位：%

復(fù)合酶制劑含有復(fù)合酶、GE 生物制劑、植物甾醇、天然植物提取物、微生態(tài)制劑、有機(jī)微量元素等由河北草酶生物科技有限公司與武漢亞維微生物科技有限公司提供?？莶菅挎邨U菌的有效活菌數(shù)≥10.0億/g，購自河南土好金生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用4×3雙因素設(shè)計(jì)，每個處理3個重復(fù)。A0組不添加枯草芽孢桿菌，A1組添加0.1%枯草芽孢桿菌，A2組添加0.2%枯草芽孢桿菌，A3組添加0.3%枯草芽孢桿菌，B0 組不添加復(fù)合酶制劑，B1 組添加0.1%復(fù)合酶制劑，B2 組添加0.2%復(fù)合酶制劑（均以鮮重為基礎(chǔ)）。本試驗(yàn)采用200 mm×300 mm 聚乙烯袋真空青貯，每袋裝青貯原料1.5 kg，且將不同的添加劑均勻噴灑于青貯原料中，于室內(nèi)常溫青貯45 d。

1.3 試驗(yàn)方法

袋開袋后，將青貯飼料均勻混合，稱取20 g 青貯樣和180 mL 蒸餾水一起放入榨汁機(jī)，榨汁1 min 左右后過濾汁液，使用4 層紗布過濾，將所得濾液用定性濾紙過濾至干凈的燒杯中。將濾液分裝為兩部分，一部分濾液為備用樣，放入-20 ℃冰箱中保存，另一部分濾液用于測定發(fā)酵指標(biāo)pH 值及氨態(tài)氮（NH3-N）、乳酸（LA）、乙酸（AA）含量。采用pH測定儀測定pH值，比色法測氨態(tài)氮（NH3-N）含量，氣相色譜測定LA和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。

將剩余青貯樣品收集，烘干后粉碎過10 目和40 目篩，用于測定青貯營養(yǎng)品質(zhì)。參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[8]，測定青貯中DM、CP、EE、Ash、NDF、ADF、WSC含量。

1.4 感官評定

采用德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（DLG）的飼料評價方法從青貯飼料的氣味、結(jié)構(gòu)、色澤等方面進(jìn)行感官評定，共分為4 個等級：1 級（20～16 分）、2 級（15～10 分）、3 級（9～5分）、4級（4～0分）[9]。

1.5 隸屬函數(shù)評價方法

采用隸屬函數(shù)評價法對不同處理青貯苜蓿的各指標(biāo)進(jìn)行評價，得出最佳處理。

式中：UX(+)為各指標(biāo)呈正相關(guān)隸屬函數(shù)值；UX(－)為各指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)隸屬函數(shù)值；X為某樣品某指標(biāo)平均測定值；Xmax為某樣品某指標(biāo)最大測定值；Xmin為某樣品某指標(biāo)最小測定值[10]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行初步處理，SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯感官評定的影響（見表2）

表2 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯感官評定的影響

由表2 可知，A2+B2 組青貯的得分最高，A0+B0 組得分最低。12 個處理組中，A0+B1 組、A1+B1 組、A1+B2 組、A2+B2 組、A3+B2 組得分均在16～20 之間，評定為等級1，其氣味芳香，無丁酸臭味；其余處理組評定為等級2，芳香味弱，有較強(qiáng)的酸味。A0+B0組、A0+B2組和A1+B0 組的葉子結(jié)構(gòu)保存較差，其他處理組莖葉結(jié)構(gòu)保持良好。各處理組的色澤均稍有變色，呈褐色。

2.2 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響（見表3）

由表3 可知，枯草芽孢桿菌與復(fù)合酶制劑處理對苜蓿青貯CP和EE含量具有顯著的交互影響（P＜0.05）。

添加復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯Ash、CP、EE和NDF含量具有顯著影響（P＜0.05）。與B0 組相比，添加復(fù)合酶制劑顯著增加了Ash和CP的含量（P＜0.05）。

添加枯草芽孢桿菌對苜蓿青貯DM、CP、NDF、ADF 和WSC 含量具有顯著影響（P＜0.05）。添加不同劑量的復(fù)合酶制劑時，A3 組DM 含量均顯著高于A0、A1組（P＜0.05）。

在B2 水平上，A2 組的CP 含量顯著高于A1 和A3 組（P＜0.05），A1 組ADF 含量顯著低于其他各組（P＜0.05）。各復(fù)合酶制劑添加水平下，苜蓿青貯WSC含量均隨著枯草芽孢桿菌添加量增加而顯著降低（P＜0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響（見表4）

由表4 可知，枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯的pH 值具有顯著交互作用（P＜0.05）。添加復(fù)合酶制劑和枯草芽孢桿菌對苜蓿青貯的pH 值、NH3-N 均具有顯著影響（P＜0.05），添加復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯的AA含量具有顯著影響（P＜0.05），而添加枯草芽孢桿菌對LA 含量具有顯著影響（P＜0.05）。在不同復(fù)合酶制劑添加水平下，A3 組NH3-N 的含量顯著高于A0 和A1 組（P＜0.05），且NH3-N 含量隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。在B1水平下，A3組的LA含量顯著高于A2組（P＜0.05）。

2.4 隸屬函數(shù)分析及綜合價值排序（見表5）

表5 隸屬函數(shù)分析及綜合價值排序

由表5 可知，DM、CP、EE、WSC、LA、AA 為正向指標(biāo)，Ash、pH值、NH3-N、NDF、ADF為負(fù)向指標(biāo)。對各處理組指標(biāo)的函數(shù)值平均并排序，平均值越大，排序越靠前，表示其綜合價值最高。各處理組的排序?yàn)锳2+B2 組＞A1+B2 組＞A3+B2 組＞A1+B1 組＞A0+B1 組＞A3+B0 組＞A2+B1 組＞A0+B2 組＞A2+B0 組＞A1+B0 組＞A3+B1組＞A0+B0組。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯感官評定的影響

青貯飼料的青貯品質(zhì)不同，其氣味、色澤、質(zhì)地、結(jié)構(gòu)等外形特征也存在差異，氣味芳香、色澤與青貯原料相近、莖葉結(jié)構(gòu)完整的青貯飼料，適口性更好。本研究中，各處理組苜蓿青貯在色澤和結(jié)構(gòu)上差異不大，添加0.2%枯草芽孢桿菌與0.2%復(fù)合酶制劑的青貯苜蓿感官評價均優(yōu)于其他處理組，無霉變，具有芳香味，色澤呈褐色，結(jié)構(gòu)良好，屬于優(yōu)質(zhì)飼料。對照組芳香味弱，具有較強(qiáng)的酸味，葉片保存不良，屬于2級青貯飼料。

3.2 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

DM 和CP 含量是評價青貯飼料營養(yǎng)成分的重要指標(biāo)[11]。本研究結(jié)果表明，苜蓿青貯的DM 含量隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而升高。Yang 等[12]指出，枯草芽孢桿菌大量繁殖可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物和菌體蛋白，這可能是DM 含量增加的原因。本研究中，添加復(fù)合酶制劑組CP 含量有一定的提升，且CP 含量隨著復(fù)合酶制劑添加量的增加呈上升趨勢，可能是由于復(fù)合酶制劑中的多種酶及營養(yǎng)物質(zhì)為乳酸菌提供了發(fā)酵底物，且補(bǔ)充了少量蛋白，其中添加0.2%復(fù)合酶制劑處理組的效果最好。本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌添加量為0.2%的處理組CP含量高于添加量為0.1%和0.3%的處理組，可能是由于枯草芽孢桿菌添加量為0.2%時，青貯飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)能夠滿足枯草芽孢桿菌的快速繁殖，且枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)，還能夠分泌多種酶系，各種酶相互協(xié)同作用生成一定量的CP[13]，提高青貯飼料中CP 含量，與張艷萍等[14]研究結(jié)果相似。NDF和ADF是反映飼料飼用價值的重要指標(biāo)，DNF和ADF含量越低，動物對其消化率越高，飼用價值越大[15]。本研究中，添加0.1%枯草芽孢桿菌組的NDF和ADF含量雖有降低，但與未添加組相比差異不顯著，與萬榮等[16]研究結(jié)果相似，表明復(fù)合酶制劑對NDF、ADF無降解作用。

3.3 枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯主要通過乳酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生LA 及少量AA，使pH值短時間內(nèi)快速降低，抑制其他微生物的繁殖與代謝，從而達(dá)到青貯效果，降低飼料的營養(yǎng)損失，延長保質(zhì)期限[17]。因此，發(fā)酵品質(zhì)直接反映了青貯品質(zhì)，而發(fā)酵品質(zhì)中乳酸含量、pH值及丙酸含量是決定發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。鄒詩雨等[18]研究表明，乳酸含量越高，丙酸含量和pH值越低，能夠有效抑制發(fā)酵過程中有害微生物的繁殖，保障青貯發(fā)酵成功。pH值是評定青貯發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)[19]，pH值低有助于乳酸菌的快速發(fā)酵，從而抑制有害菌生長，減緩蛋白質(zhì)降解，減少丙酸（PA）、丁酸（BA）等物質(zhì)生成[20]。優(yōu)質(zhì)青貯飼料pH 值在4.2～4.8之間為良好，4.8以上則認(rèn)為發(fā)酵品質(zhì)較差[21]。本研究中，添加0.1%復(fù)合酶制劑或同時添加0.1%復(fù)合酶制劑和0.1%枯草芽孢桿菌的處理組pH值較理想。

NH3-N含量能夠反映青貯過程中蛋白質(zhì)的降解情況，蛋白質(zhì)降解越嚴(yán)重，NH3-N 含量越高，不利于優(yōu)質(zhì)青貯飼料形成[22]。青貯飼料發(fā)酵過程會產(chǎn)生LA、AA、PA 和BA，LA 占比越大，BA 占比越小，青貯效果越好[23]，Lara 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌會降低玉米青貯中的LA含量，與本研究結(jié)果相似。3.4 隸屬函數(shù)分析及綜合價值排序

由于枯草芽孢桿菌與復(fù)合酶制劑存在交互作用，各處理不同指標(biāo)的趨勢不同，以任意單一的指標(biāo)評定最優(yōu)組合較為片面。因此，為合理、全面地評定其營養(yǎng)價值，將各處理組的11 個指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，求得平均值，值越大代表其青貯效果越好。本試驗(yàn)通過對隸屬函數(shù)的分析得出，0.2%枯草芽孢桿菌+0.2%復(fù)合酶制劑組的平均值最大，表明同時添加0.2%枯草芽孢桿菌和0.2%復(fù)合酶制劑青貯效果最好。

4 結(jié)論

本研究表明，添加枯草芽孢桿菌和復(fù)合酶制劑均在不同程度上改善了苜蓿青貯品質(zhì)，降低了營養(yǎng)物質(zhì)損失。枯草芽孢桿菌與復(fù)合酶制劑對CP、EE、pH 值存在交互作用。同時添加0.2%枯草芽孢桿菌和0.2%復(fù)合酶制劑對紫花苜蓿青貯效果較好。