盧 俊

（廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工學(xué)院，廣西 南寧 530001）

核桃（JuglansregiaL.）又名胡桃、羌桃，胡桃科胡桃屬落葉喬木植物，是一種傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1-2]。核桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[3-4]。核桃青皮是核桃果實(shí)采摘后的副產(chǎn)品，往往作為垃圾被扔掉，造成資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。研究表明，核桃青皮含有豐富的氨基酸、黃酮、多糖、揮發(fā)油、生物堿等活性成分[5-7]，具有抗氧化、降血糖血脂、抑菌活性等藥理功效[8-10]。因核桃青皮總黃酮具有多種生物學(xué)活性[11-12]，將核桃青皮作為功能型飼料，具有廣闊的應(yīng)用前景。馬菁菁等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在雞飼糧中添加核桃青皮黃酮粗提物可有效提升肉雞生產(chǎn)性能及抗氧化功能。吳瑩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中添加核桃青皮黃酮類(lèi)化合物可以提高動(dòng)物的免疫力。本試驗(yàn)以核桃青皮為研究對(duì)象，采用超聲波輔助法提取核桃青皮中總黃酮含量，考察4 個(gè)單因素對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響，應(yīng)用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化其最優(yōu)提取工藝條件，為核桃青皮總黃酮提取工業(yè)化生產(chǎn)及其資源開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，二苯基苦基肼自由基購(gòu)自廣州皓安生物科技有限公司，維生素C（VC）購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，硝酸鋁（分析純）購(gòu)自沈陽(yáng)從科化工有限公司，氫氧化鈉（分析純）購(gòu)自濟(jì)南榮正化工有限公司，乙酸鉀（分析純）購(gòu)自山東旭祥化工有限公司，無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)自西安天茂化工有限公司，水為《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）規(guī)定一級(jí)水。

1.2 儀器設(shè)備

UV759CRT 紫外分光光度計(jì)購(gòu)自青島聚創(chuàng)華業(yè)分析儀器有限公司，ESJ208-S沈陽(yáng)龍騰電子分析天平購(gòu)自沈陽(yáng)龍騰電子有限公司，DFY-200A 汗諾搖擺式粉碎機(jī)購(gòu)自上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司，JM-16D-80 超聲清洗機(jī)購(gòu)自廣東潔盟超聲實(shí)業(yè)有限公司，TQR5-S臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙市鴻運(yùn)儀器公司，60 目標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩購(gòu)自上海過(guò)望化工有限公司，TWS-12 電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海勞達(dá)貿(mào)易有限公司，B1140 得利特超純水機(jī)購(gòu)自北京得利特科技有限公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 核桃青皮總黃酮提取工藝流程

核桃鮮果→果皮分離得到核桃青皮→將核桃青皮晾干→粉碎→80 目篩網(wǎng)過(guò)篩→將核桃青皮粉末脫脂→稱(chēng)取脫脂樣品進(jìn)行超聲輔助提取→離心→濃縮上清液→黃酮粗提液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

將烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用70%乙醇超聲輔助溶解，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[15-16]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.050 g（精確至0.001 g）于1 000 mL棕色容量瓶中，使用70%的乙醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.05 g/L 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液。使用移液槍分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)中間液0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、5.00 mL 置于6 支10 mL 棕色容量瓶中，依次加入6% NaNO2溶液2 mL，旋渦振蕩搖勻，靜置10 min；加入12% Al(NO)3溶液1 mL，旋渦振蕩搖勻，靜置15 min；加入4% NaOH 溶液2 mL，充分搖勻，靜置6 min；以70%乙醇溶液定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.025 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液。以空白試劑作對(duì)照，在510 nm處測(cè)定溶液的吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程Y=0.8761X+0.1545，R2=0.999 8。

1.3.3 核桃青皮總黃酮的提取及含量的測(cè)定

將自然晾干的核桃青皮粉碎，過(guò)80目篩，取適量樣品粉末，使用石油醚回流脫脂處理；準(zhǔn)確稱(chēng)取已脫脂處理的核桃青皮粉末樣品1.000 g（精確至0.001 g）于50 mL 具塞離心管中，在超聲輔助提取儀中按照液料比20 mL/g 加入70%乙醇溶液作為提取溶劑，60 ℃提取40 min，提取完畢后于8 000 r/min 離心20 min，將上清液移至250 mL棕色容量瓶中。殘?jiān)韵嗤瑮l件提取2次，合并提取液，使用70%乙醇溶液定容至刻度，即得核桃青皮總黃酮粗提液。

準(zhǔn)確吸取1 mL核桃青皮總黃酮粗提液于10 mL棕色容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液的條件顯色，在相同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，將吸光度值代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算黃酮含量。

式中：X為核桃青皮總黃酮含量（%）；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到待測(cè)試樣液總黃酮的數(shù)值（g/L）；V為提取液體積（mL）；D為稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇濃度、液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間等4 個(gè)單因素對(duì)核桃青皮總黃酮提取得率的影響。核桃青皮總黃酮提取的單因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 核桃青皮總黃酮提取的因素水平設(shè)計(jì)

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置4 個(gè)因素為自變量，核桃青皮總黃酮提取得率為因變量，為優(yōu)化核桃青皮總黃酮提取工藝參數(shù)，采用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.3.6 核桃青皮總黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.6.1 DPPH自由基清除率

參考文獻(xiàn)[17]至文獻(xiàn)[18]，準(zhǔn)確稱(chēng)取二苯基苦基肼（DPPH）10 mg 于100 mL 棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，超聲輔助溶解，配成100 mg/L DPPH 儲(chǔ)備液于2～4 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存。用無(wú)水乙醇將核桃青皮總黃酮提取液分別稀釋為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的樣品溶液。精確吸取2.0 mL 樣品溶液于6 支10 mL 棕色容量瓶中，分別加入2 mL的100 mg/L DPPH 儲(chǔ)備液，定容搖勻，置于黑暗處?kù)o置30 min 于510 nm 處測(cè)定吸光度A1；取相同體積核桃青皮總黃酮提取液，以無(wú)水乙醇代替DPPH 儲(chǔ)備液，按照上述方法處理后在510 nm 處測(cè)定吸光度A2；以2.0 mL 無(wú)水乙醇代替核桃青皮總黃酮提取液，加入2 mL 100 mg/L DPPH 儲(chǔ)備液，按照上述方法處理后在510 nm 處測(cè)定其吸光度A0；以VC 為陽(yáng)性對(duì)照，精密稱(chēng)取一定量的VC標(biāo)準(zhǔn)品配制成相應(yīng)濃度，操作方法同樣品組。計(jì)算核桃青皮總黃酮提取液對(duì)DPPH 自由基清除率。

1.3.6.2 羥自由基清除率

參考文獻(xiàn)[19]至文獻(xiàn)[20]，取6支10 mL棕色容量瓶，分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L核桃青皮總黃酮提取液各2.0 mL。依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、8 mmol/L 水楊酸溶液2.0 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，充分搖勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，以蒸餾水調(diào)零，將樣品反應(yīng)液于510 nm處測(cè)定吸光度A1；取相同體積核桃青皮總黃酮提取液，以蒸餾水代替H2O2，按照上述方法處理后在510 nm處測(cè)定吸光度A2；以蒸餾水代替核桃青皮總黃酮提取液，其他條件不變，在510 nm處測(cè)定其吸光度A0；以VC為陽(yáng)性對(duì)照，精密稱(chēng)取一定量的VC標(biāo)準(zhǔn)品配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度，操作方法同樣品組。計(jì)算核桃青皮總黃酮提取液對(duì)羥自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Design-Expert 10.0 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 乙醇濃度對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖1 可知，總黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加呈先增加后降低趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，核桃青皮總黃酮提取得率達(dá)到最大值4.81%。原因可能是乙醇濃度較低時(shí)，水分含量相對(duì)較高使樣品中總黃酮未能完全溶解，從而導(dǎo)致總黃酮提取得率較低[21]；當(dāng)乙醇濃度過(guò)高則極性降低，樣品中脂溶性和醇溶性物質(zhì)溶出，使黃酮提取得率有所降低。因此選擇乙醇濃度為70%為宜。

2.1.2 液料比對(duì)核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見(jiàn)圖2）

圖2 液料比對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖2 可知，隨著液料比逐漸增大，核桃青皮總黃酮的提取得率隨著溶劑增多而逐漸增大，當(dāng)液料比達(dá)到20 mL/g，核桃青皮總黃酮的提取得率增速趨于平緩。原因是逐漸增加提取溶劑的體積有利于擴(kuò)大樣品與提取溶劑的接觸面積，更有利于樣品中總黃酮溶出，故液料比低于20 mL/g時(shí)，核桃青皮總黃酮的提取得率隨著液料比的增加而急劇增加；但液料比高于20 mL/g時(shí)，樣品中總黃酮已基本完全溶出，故樣品中總黃酮提取得率增長(zhǎng)緩慢。因此，從經(jīng)濟(jì)以及節(jié)約資源角度考慮，選擇液料比為20 mL/g為宜。

2.1.3 浸提溫度對(duì)核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見(jiàn)圖3）

圖3 浸提溫度對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖3 可知，隨著浸提溫度的逐漸增加總黃酮得率呈先增大后降低的趨勢(shì)；當(dāng)浸提溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮提取得率達(dá)到最大值4.97%；繼續(xù)增加浸提溫度黃酮提取得率反而降低。原因是在一定浸提溫度范圍內(nèi)升溫會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物分子擴(kuò)散速率加快，從而有利于增大其溶解度，故在一定范圍內(nèi)隨著浸提溫度的升高總黃酮提取得率也呈上升趨勢(shì)[22]；但當(dāng)浸提溫度達(dá)到一定時(shí)，繼續(xù)增加浸提溫度，黃酮類(lèi)化合物會(huì)在高溫下被破壞，使提取得率有所降低。因此浸提溫度選擇60 ℃為宜。

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)核桃青皮總黃酮提取得率的影響（見(jiàn)圖4）

圖4 浸提時(shí)間對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響

由圖4 可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)核桃青皮總黃酮得率呈先增加后降低趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為40 min 時(shí)總黃酮提取得率達(dá)到最大值4.79%。原因可能是延長(zhǎng)超聲波的作用，可以使植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞率增加，使更多的總黃酮從核桃青皮中溶出，故總黃酮得率增加。當(dāng)浸提時(shí)間大于40 min 時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，總黃酮得率呈下降趨勢(shì)。原因可能是樣品長(zhǎng)時(shí)間處于超聲波作用下，超聲輔助提取儀產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化效應(yīng)會(huì)對(duì)總黃酮結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[23]。因此選擇浸提時(shí)間為40 min為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及方差分析結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 10.0 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和模型的顯著性分析，得到回歸模型方程為：Y=5.41+0.011A+0.063 0B+0.19C+0.21D-0.002 5AB-0.025 0AC+0.037AD-0.11BC+0.053BD+0.082CD-0.31A2-0.14B2-0.26C2-0.28D2。

回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4的回歸分析結(jié)果可知，模型的F值為44.14（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)為3.30（P＞0.05），表明模型擬合度較好[24-26]。模型的校正決定系數(shù)RAdj2=0.971 2，表明該模型可以解釋黃酮得率的變化有97.12%來(lái)自乙醇濃度、液料比、浸提溫度和浸提時(shí)間。因此用該模型能較好地預(yù)測(cè)和分析核桃青皮總黃酮的提取工藝。由F值可知，4個(gè)單因素對(duì)黃酮得率影響排序?yàn)榻釙r(shí)間（D）＞浸提溫度（C）＞液料比（B）＞乙醇濃度（A）。響應(yīng)面分析可知，CD具有顯著影響（P＜0.05），B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2具有極顯著影響(P＜0.01)。

表4 回歸模型的方差分析結(jié)果

2.2.2 因素交互作用對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響（見(jiàn)圖5）

圖5 各因素交互作用對(duì)核桃青皮總黃酮得率的影響

相應(yīng)面越陡峭、等高線(xiàn)圖呈橢圓形表明兩交互作用對(duì)黃酮提取得率影響越顯著[27-29]。

由圖5 可知，交互項(xiàng)BC 和CD 的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，且等高線(xiàn)呈橢圓，表明液料比與浸提溫度、浸提溫度與浸提時(shí)間對(duì)核桃青皮總黃酮得率影響達(dá)到顯著水平或極顯著水平，與表4方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 回歸模型最優(yōu)試驗(yàn)組合驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面軟件得到核桃青皮總黃酮提取得率模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)參數(shù)工藝為乙醇濃度68.87%、液料比19.7 mL/g、浸提溫度62.5 ℃、浸提時(shí)間38.89 min，模型預(yù)測(cè)核桃青皮總黃酮提取得率為6.02%。為方便試驗(yàn)操作，確定最終工藝參數(shù)條件為乙醇濃度70%、液料比20 mL/g、浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間40 min，實(shí)際測(cè)得核桃青皮總黃酮提取得率為6.13%，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明回歸模型對(duì)核桃青皮總黃酮提取得率預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 抗氧化活性結(jié)果分析

2.3.1 核桃青皮總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除能力（見(jiàn)圖6）

圖6 核桃青皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖6 可知，核桃青皮總黃酮與VC 對(duì)DPPH 自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢(shì)，核桃青皮黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力相對(duì)VC整體稍低。當(dāng)核桃青皮總黃酮濃度為1.0 g/L 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除率為94.98%，與等質(zhì)量濃度的VC對(duì)DPPH自由基的清除能力相近。因此，核桃青皮總黃酮對(duì)DPPH 自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3.2 核桃青皮總黃酮對(duì)羥自由基清除能力（見(jiàn)圖7）

圖7 核桃青皮總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力

由圖7 可知，核桃青皮總黃酮對(duì)羥自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加上升趨勢(shì)。當(dāng)核桃青皮總黃酮濃度為1.0 g/L 時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為89.89%，略低于同濃度下的VC對(duì)羥自由基的清除能力。因此，核桃青皮總黃酮對(duì)羥自由基具有一定的清除能力。

3 結(jié)論

本研究表明，核桃青皮總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度70%、液料比20 mL/g、浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間40 min，實(shí)際測(cè)得核桃青皮總黃酮提取得率6.13%，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明回歸模型準(zhǔn)確可靠。體外抗氧化活性研究表明，質(zhì)量濃度為1.0 g/L 的核桃青皮總黃酮提取液對(duì)DPPH 自由基和羥自由基清除率分別為94.98%、89.89%，略低于同質(zhì)量濃度的VC 的抗氧化能力，但仍表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用。