馬 煥 張秀江 胡 虹 馮 菲 解復(fù)紅 向凌云 武艷芳 刁文濤

（1．河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2．河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450008；3．棕櫚生態(tài)城鎮(zhèn)發(fā)展股份有限公司，河南 鄭州 450000）

α - 半乳糖苷酶（α -galactosidase， α -gal， EC 3.2.1.22）能夠特異性地水解蜜二糖、水蘇糖、人B 型紅細(xì)胞抗原和pNPG等底物，使底物中的非還原性末端α-1,6-半乳糖苷鍵斷裂，釋放位于底物末端的半乳糖殘基。單胃動(dòng)物腸道內(nèi)沒(méi)有α-半乳糖苷酶，不能吸收利用玉米-豆粕型飼糧中含有的α-半乳糖苷類(lèi)物質(zhì)等抗?fàn)I養(yǎng)因子。將α-半乳糖苷酶作為飼用酶制劑可消除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子帶來(lái)的不良反應(yīng)，提高飼料的利用率和單胃動(dòng)物的進(jìn)食量[1]。但目前的α-半乳糖苷酶的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式主要是從動(dòng)物、植物中提取和利用微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，這些傳統(tǒng)方法普遍存在酶的活性以及生產(chǎn)的效率不高、酶的熱穩(wěn)定性不好、提取的工藝復(fù)雜等問(wèn)題。在實(shí)際工業(yè)化飼料生產(chǎn)中，α-半乳糖苷酶受到了耐溫性等方面的約束和限制。

為獲得耐溫性較高的α-半乳糖苷酶，本試驗(yàn)將改造株鏈球菌（Streptococcus）來(lái)源的α-半乳糖苷酶基因Gal27A，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至畢赤酵母進(jìn)行高效表達(dá)，對(duì)耐溫性提高的重組酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步探討，以期獲得耐高溫的α-半乳糖苷酶，為α-半乳糖苷酶在飼料添加劑中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來(lái)源

大腸桿菌（Escherichiacoli）Top10 感受態(tài)細(xì)胞由江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司提供；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115細(xì)胞、畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA均由武漢淼靈生物科技有限公司提供；α-半乳糖苷酶基因GalA為根據(jù)Genebank 中登錄的氨基酸序列（XM_001390670.1），委托華大基因股份有限公司進(jìn)行密碼子改造后合成。

1.1.2 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑

YPD 酵母培養(yǎng)基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、瓊脂2%，pH值自然。

YPDS培養(yǎng)基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、山梨醇18.22%、瓊脂2%，pH值自然。

低鹽LB：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、瓊脂2%，pH值自然。

MRS肉湯培養(yǎng)基：山梨醇。

處理液：100 mmol/L 醋酸鋰（LiAc）、10 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）、0.6 mol/L 山梨醇、10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5。

限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、Not Ⅰ由美國(guó)賽默飛世爾科技公司提供；T4 連接酶、FastPfu DNA 聚合酶、引物GAP-mF、GAP-mF、3'AOX1、博來(lái)霉素（zeocin）均由鄭州森美生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 α-半乳糖苷酶突變質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)Genebank 中登錄的GalA 氨基酸序列（XM_001390670.1）合成α-半乳糖苷酶基因Gal27A[2-3]，并在兩端設(shè)計(jì)酶位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ。對(duì)基因和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，利用T4 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Top10 感受態(tài)細(xì)胞[4-5]，涂布于低鹽LB抗性平板（zeocin 30 mg/L），提取重組質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A。

1.2.2 畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備

使用滅菌后的牙簽挑取轉(zhuǎn)化至畢赤酵母的單菌落，接種到Y(jié)PD（3 mL/管）液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)24 h。取3 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 充分振蕩5～6 h，OD600nm1.0～1.3 時(shí)收集細(xì)胞。4 ℃離心收集菌體，沉淀用預(yù)冷的無(wú)菌水沖洗2 次，離心，25 mL 處理液30 min（室溫），再次4 ℃離心收集菌體，1 mol/L 山梨醇重懸細(xì)胞（2 次），8 000 r/min離心10 min。細(xì)胞重懸在2 mL的1 mol/L山梨醇溶液中制成感受態(tài)細(xì)胞，分裝于80 μL/管，-70 ℃保存。

1.2.3 易錯(cuò)PCR

使用普通的Taq 酶作為聚合酶，將10 mmol/L 的dGTP 和5 mmol/L MnCl2加入反應(yīng)體系中（50 μL），使MnCl2在PCR反應(yīng)體系中的終濃度達(dá)到0.3～1.0 mmol/L。

將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A 為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR，反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化

PCR產(chǎn)物切膠回收和沉淀DNA[6-7]：加入1/10倍體積的飽和醋酸鈉（pH值5.3）和3倍體積乙醇，12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液；加入200 μL 70%乙醇進(jìn)行清洗，12 000 r/min 離心10 min，棄掉上清液，在室溫環(huán)境中自然晾干，直到乙醇完全揮發(fā)，加入10 μL無(wú)菌去離子水溶解PCR反應(yīng)所得到的產(chǎn)物，測(cè)定DNA水平[8]。

1.2.5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化

取80 μL GS115 酵母感受態(tài)細(xì)胞和10 μg 的線(xiàn)性化質(zhì)粒[8]，兩者混合后轉(zhuǎn)移至2 mm 電轉(zhuǎn)杯（4 ℃預(yù)冷）中，冰上靜置5 min；電擊至GS115 酵母感受態(tài)細(xì)胞中[9-10]，設(shè)置電壓為1.5 kV，脈沖6 ms（1.5 kV，200 Ω，25 μF）；電擊后加入200 μL 提前4 ℃預(yù)冷的1 mol/L 山梨醇溶液中，重懸細(xì)胞，從電轉(zhuǎn)杯中轉(zhuǎn)移重懸液到1.5 mL 離心管中，30 ℃金屬浴培養(yǎng)1 h；將培養(yǎng)物涂布于YPDS抗性平板上，培養(yǎng)箱30 ℃避光培養(yǎng)3 d。

1.2.6 α-半乳糖苷酶耐熱性突變體的篩選

牙簽挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆162個(gè)，接于5 mL/管YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)3 d；12 000 r/min離心2 min收集上清液，用上清測(cè)定酶活。

1.2.7 α-半乳糖苷酶酶活測(cè)定

取1.5 mL離心管，加入稀釋的酶液90 μL和pH值4.5的緩沖液10 μL 及10 mmol/L pNPG 溶液100 μL，水浴65 ℃反應(yīng)10 min，水中冷卻，加入800 μL 的Na2CO3（0.5 mol/L）溶液終止反應(yīng)，OD405nm處測(cè)定吸光值[11-14]。

α-半乳糖苷酶酶活定義：在一定條件下，每分鐘分解底物（pNPG）生成1 μmoL對(duì)硝基苯酚（pNPG）所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.8 酵母基因組DNA的提取

在轉(zhuǎn)化好的平板上挑取單克隆菌落于1.5 mL 離心管中，加入100 μL裂解液（0.2 mol/L乙酸鋰，1%十二烷基磺酸鈉）后重懸細(xì)胞，75 ℃加熱10 min，加入無(wú)水乙醇300 μL，用70%乙醇漂洗DNA，離心，放置室溫至無(wú)味，加入無(wú)菌水50 μL 溶解沉淀，離心5 min，以上清液為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。挑選耐熱突變體保溫前后的酶活比高于野生型的單克隆，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR 檢測(cè)，檢測(cè)成功的PCR產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

在最適pH 值6.5 條件下，按1.2.7 方法測(cè)定不同溫度（30～80 ℃）下的α-半乳糖苷酶，以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

酶液分別置于不同水?。?0～80 ℃），保溫10 min，冷卻，測(cè)定α-半乳糖苷酶的殘余酶活力，根據(jù)酶活力計(jì)算相對(duì)酶活力，以未經(jīng)溫度處理的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

分別以磷酸二氫鉀-檸檬酸配制一系列的緩沖液，pH 值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 的緩沖液。酶液使用不同pH 值的緩沖液稀釋?zhuān)谧钸m溫度65 ℃條件下測(cè)定α-半乳糖苷酶活力，以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

將酶液與不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）的緩沖液混合，冰上處理1 h，測(cè)定α-半乳糖苷酶的殘余酶活力，以酶活力最高者是100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

在α-半乳糖苷酶反應(yīng)體系中加入Mg2+、K+、Na+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Cu2+、Ag2+、Mn2+、EDTA（終濃度為1 mmol/L），測(cè)定α-半乳糖苷酶的殘余酶活，以未加金屬離子的酶活力為100%，計(jì)算酶活力保留率。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果（見(jiàn)圖1）

圖1 質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A酶切檢測(cè)結(jié)果

由圖1 可知，表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A 構(gòu)建成功。

2.2 易錯(cuò)PCR體系中MnCl2濃度（見(jiàn)圖2）

圖2 pGAPZαA-Gal27A易錯(cuò)PCR中MnCl2濃度

PCR 體系中加入dGTP（終濃度為0.5 mmol/L）和MnCl2（終濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L）。由圖2 可知，0.3、0.4 mmol/L 試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物中均有明顯pGAPZαA-Gal27A條帶。

2.3 質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A易錯(cuò)PCR（見(jiàn)圖3）

圖3 質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A易錯(cuò)PCR

由圖3可知，易錯(cuò)PCR產(chǎn)生了特異性的PCR條帶。

2.4 耐熱突變體工程菌的構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115 中，在含100 mg/L zeocin 的YPDS 平板上篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)所有克隆的發(fā)酵液的α-半乳糖苷酶耐熱性進(jìn)行檢測(cè)[15]。

2.5 α-半乳糖苷酶耐熱突變體酶活測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和酶活定義[11,16-17]將篩選出的耐熱突變體29 和54 在55 ℃保溫10 min，保溫前酶活為12.086、16.861 U/mL，保溫后的酶活為2.438、3.273 U/mL，保溫前后保留酶活比分別為20.21%和19.41%，野生型菌株55 ℃保溫10 min后保留酶活比為13.12%，相比較得出加熱前后的保留酶活比增幅大于45%。

2.6 突變體轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

pGAPZαA-Gal27A易錯(cuò)PCR結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 PCR引物

pGAPZαA-Gal27A易錯(cuò)PCR結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4基因組PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠結(jié)果可見(jiàn)分子量正確的特異性PCR條帶，說(shuō)明Gal27A已經(jīng)成功重組進(jìn)酵母基因組中。

圖4 pGAPZαA-Gal27A易錯(cuò)PCR結(jié)果

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，基因突變結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 基因突變結(jié)果

由表2 可知，29 號(hào)和54 號(hào)的堿基突變率分別為0.017 5%、0.292%[18-19]，收集重組菌的發(fā)酵液，研究其酶學(xué)性質(zhì)。

2.7 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.7.1 溫度對(duì)重組酶活性和穩(wěn)定性的影響（見(jiàn)圖5）

圖5 溫度對(duì)重組酶活性和穩(wěn)定性的影響

由圖5 可知，溫度為35～60 ℃，相對(duì)酶活力穩(wěn)定在45%～80%，期間相對(duì)酶活隨著溫度上升而增加；65 ℃保溫10 min，相對(duì)酶活力達(dá)最高90%；65 ℃后，相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì)；80 ℃保溫10 min，相對(duì)酶活力保持在35%左右，表明該重組酶的最適溫度為65 ℃。

溫度從35 ℃緩慢上升至55 ℃，相對(duì)酶活力變化不大；溫度為60 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力下降至48%，相比55 ℃時(shí)下降了40%；隨著溫度增加，相對(duì)酶活力也隨之下降；80 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力為10%。

2.7.2 pH值對(duì)重組酶活性和穩(wěn)定性的影響（見(jiàn)圖6）

圖6 pH值對(duì)重組酶活性和穩(wěn)定性的影響

由圖6 可知，該酶的最適pH 值是6.5。pH 值3.5～7.5時(shí)，相對(duì)酶活力隨著pH值增加而增加，說(shuō)明該酶具有較廣泛的pH值范圍。

2.7.3 金屬離子對(duì)重α-半乳糖苷酶活力的影響（見(jiàn)表3）

表3 金屬離子對(duì)重α-半乳糖苷酶活力的影響

由表3可知，金屬離子Ag2+、Hg2+對(duì)該重組酶具有較強(qiáng)的抑制作用，Mg2+、Ca2+、K+和EDTA對(duì)酶活力影響不大，Cu2+和Na+對(duì)該酶具有一定的促進(jìn)作用，以Cu2+的促進(jìn)作用較為明顯。

3 討論

自然界中產(chǎn)α-半乳糖苷酶的微生物很多，原菌發(fā)酵產(chǎn)酶的產(chǎn)量高低不一，部分還需要特定的誘導(dǎo)條件，低產(chǎn)量和高成本使得該方法不適用于工業(yè)化生產(chǎn)，工程菌相較具有較大的優(yōu)勢(shì)[18]。找到高表達(dá)且活性高的α-半乳糖苷酶基因，并進(jìn)行克隆表達(dá)的方法受到了國(guó)內(nèi)外研究者的青睞。國(guó)內(nèi)外對(duì)這一方面的研究已取得一定進(jìn)展，α-半乳糖苷酶基因工程表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母、枯草芽孢桿菌和昆蟲(chóng)等。但由于大腸桿菌缺乏對(duì)真核蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)，細(xì)胞周質(zhì)含有多種內(nèi)毒素等缺點(diǎn)不利于進(jìn)行真核生物源蛋白的表達(dá)。目前，利用畢赤酵母、生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的研究較多，如來(lái)自Bisporasp.MEY-1、Penicilliumsp. F63、Rhizomucormiehei等的α-半乳糖苷酶基因均已在酵母中實(shí)現(xiàn)了有效的胞外表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)96 h 后，利用pNPG 法測(cè)定的酶活分別為105、111、240 U/mL[19]。

在飼料中添加α-半乳糖苷酶可解決豆粕型飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子（多聚糖和低聚糖等）的問(wèn)題，對(duì)提高豆粕蛋白能量利用率及有改善消化均具有較明顯的效果。酶在加工應(yīng)用過(guò)程中先經(jīng)受原料混合、加工高溫制粒后才能夠在動(dòng)物胃腸道溶解發(fā)生作用，因此酶制劑的溫度和穩(wěn)定性備受關(guān)注[20]。

本試驗(yàn)以提高α-半乳糖苷酶的耐熱性為目的，圍繞篩選出α-半乳糖苷酶的耐熱性突變體，解決α-半乳糖苷酶在高溫下易喪失活性甚至失活這一問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A，控制MnCl2濃度，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)擴(kuò)增使其堿基發(fā)生錯(cuò)配，將易錯(cuò)PCR過(guò)程完成后的表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-Gal27A 通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入感受態(tài)的畢赤酵母GS115 表達(dá)系統(tǒng)，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了重組表達(dá)。溫度在35～55 ℃之間較穩(wěn)定，相對(duì)酶活力一直穩(wěn)定在90%以上；溫度大于55 ℃，相對(duì)酶活力下降迅速；當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，相對(duì)酶活力僅為10%，可見(jiàn)該酶的溫度穩(wěn)定性較差。該酶最適pH 值是6.5，pH 值在4.0～7.0 范圍內(nèi)相對(duì)酶活力較高，但是該酶的pH 值應(yīng)用范圍不是很廣。Heravi 等[21]克隆了一種來(lái)自TalaromycesleycettanusJCM12802 的新型α-半乳糖苷酶基因也實(shí)現(xiàn)了酵母表達(dá)，但是與本試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)比，本試驗(yàn)篩選出的突變體不具有更高的耐溫性和pH值廣泛性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)易錯(cuò)PCR 對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法，獲得了兩個(gè)株鏈球菌（Streptococcus）來(lái)源的α-半乳糖苷酶Gal27A 的耐熱突變體，分別是29 號(hào)和54 號(hào)耐熱突變體。對(duì)應(yīng)這兩個(gè)突變體的氨基酸T32A、N16D、N44S、E412G 有突變時(shí)，測(cè)定α-半乳糖苷酶酶活并與野生型對(duì)比，結(jié)果顯示在耐熱性方面顯著提升。使用畢赤酵母系統(tǒng)對(duì)該酶進(jìn)行了異源表達(dá)，該酶具有良好的酶學(xué)性質(zhì)，該酶的最適反應(yīng)溫度是65 ℃，65 ℃以下保溫1 h，相對(duì)酶活力保留達(dá)到75%以上，說(shuō)明該酶在30～65 ℃的熱穩(wěn)定性較好。最適pH 值是6.5，pH 值在4.0～7.0 時(shí)可保持35%以上的對(duì)酶活力。本研究中的耐高溫突變體文庫(kù)具有較好的酶學(xué)性能。