沈 童 吳 華 陳鑫磊 刁明勇 李金銘 王 碩 武小慶 行倩文

（青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016）

青海省特色野生植物黑果枸杞含有豐富的花青素。花青素別名花色苷，是水溶性類黃酮色素的重要亞類[1-2]?；ㄇ嗨鼐哂薪档托难芗膊〉陌l(fā)生率等多種生物功效，特別是抗炎、抗氧化的功效得到廣泛報道[3]?？笛┭郲4]研究花青素對豬睪丸細胞的毒性和豬傳染性胃腸炎病毒的作用，發(fā)現(xiàn)花青素對豬傳染性胃腸炎病毒具有一定的治療效用。Csernus 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，花青素可以改善受脂多糖LPS 影響的肉雞生長性能、炎癥參數(shù)和腸道形態(tài)。Tian 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，調(diào)節(jié)腸道微生物群結(jié)構。

大量研究表明，氧化應激會引起心肌細胞的功能損傷，從而成為心血管等疾病的發(fā)病緣由[3]，而缺氧能夠引起氧化應激對機體造成組織損傷。目前鮮見關于黑果枸杞花青素對心肌細胞氧化應激損傷的報道。因此，本試驗探究黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響，為深入研究黑果枸杞花青素改善氧化應激所引起的損傷及其相關分子機制提供參考，也為其對動物機體的免疫作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

本試驗所用的H9c2 大鼠心肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物及試劑

黑果枸杞花青素（純度64.4%，青海金麥杞生物科技有限公司）；DMEM 干粉、胎牛血清、雙抗（Gibco公司）；PBS（Hfart 公司）；胰蛋白酶EDTA 溶液0.25%（Solarbio 公司）；青霉素-鏈霉素混合液（武漢普諾賽生命科技有限公司）；RIPI（強）裂解液（陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司）。

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超微量Ca2+-ATP 酶、超微量Na+K+-ATP 酶、總蛋白（TP）測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；大鼠血紅素氧合酶-1 （HO-1） 測定、大鼠白細胞介素-6（IL-6）、大鼠白細胞介素-10（IL-10）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測定試劑盒由江蘇酶免實業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗儀器

超凈工作臺（江蘇通凈凈化設備有限公司），臺式電熱恒溫鼓風干燥箱及CO2細胞培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司），MIC-101 細胞低氧小室-細胞缺氧-細胞高氧富氧培養(yǎng)倉（杭州Aipu Instrument Equipment 有限公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），酶標儀（意大利MuLTISKAN 公司）。

1.4 細胞培養(yǎng)

將H9c2 大鼠心肌細胞置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)（10%胎牛血清+1%雙抗DMEM 培養(yǎng)基），待細胞生長約70%～80%融合時進行傳代，2～3 d進行一次細胞傳代，培養(yǎng)足夠的細胞。

1.5 細胞分組及處理

將H9c2 大鼠心肌細胞以每孔5×105個細胞接種于24 孔板，每組3 個復孔，分組處理后置細胞培養(yǎng)箱（37 ℃ 5% CO2飽和濕度）中進行常規(guī)培養(yǎng)24 h 后收集細胞。將培養(yǎng)好的心肌細胞分成常氧組、常氧+AC 組、低氧組和低氧+AC組。

常氧+AC 組和低氧+AC 組用50 mg/L AC 預處理12 h，令細胞貼壁及生長到合適的細胞密度。常氧組與常氧+AC 組放置CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，低氧組與低氧+AC 組放置細胞1%氧濃度低氧小室中低氧處理24 h。其中氧濃度使用MIC-101 細胞低氧小室-細胞缺氧-細胞高氧富氧培養(yǎng)倉控制氧濃度，每組設置3 個重復。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 細胞抗氧化因子

細胞計數(shù)后，以每孔1×105個接種于96 孔板中，按上述分組進行試驗，取各組細胞上清液，利用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細胞上清液抗氧化因子CAT、MDA、SOD、GSH-Px、HO-1 活性，試劑盒需提前20 min 從冰箱中取出平衡至室溫，按試劑盒說明書進行操作。

1.6.2 細胞能量代謝相關因子

細胞計數(shù)后，以每孔1×105個接種于96 孔板中，按上述分組進行試驗，取各組細胞上清液，按檢測試劑盒說明書進行處理，通過定磷法檢測各組細胞Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性。

1.6.3 細胞炎癥因子

細胞計數(shù)后，以每孔1×105個接種于96 孔板中，按上述分組進行試驗，取各組細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細胞上清液炎性相關因子IL-6、IL-10、TNF-α 的含量，試劑盒需提前20 min 從冰箱中取出平衡至室溫，按照試劑盒說明進行操作。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進行初步處理，SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，Duncan's 法進行多重比較。結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞抗氧化因子指標的影響（見表1）

表1 黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細胞抗氧化因子活性的影響

由表1 可知，與常氧組相比，常氧+AC 組大鼠心肌細胞CAT、HO-1 活性顯著升高（P＜0.05），GSH-Px、SOD 活性均極顯著升高（P＜0.01），MDA 的含量顯著降低（P＜0.05）；低氧組大鼠心肌細胞GSH-Px、HO-1 活性均顯著降低（P＜0.05），CAT、SOD 活性均極顯著降低（P＜0.01），MDA 含量極顯著升高（P＜0.01）。

與低氧組相比，低氧+AC 組大鼠心肌細胞CAT、GSH-Px、SOD 和HO-1 活性均極顯著升高（P＜0.01），MDA 含量極顯著降低（P＜0.01）。

結(jié)果表明，黑果枸杞花青素可通過上調(diào)抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD、HO-1 的生成并下調(diào)過氧化產(chǎn)物MDA 的含量提高H9c2 大鼠心肌細胞的抗氧化水平。

2.2 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞能量代謝相關因子的影響（見表2）

表2 黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細胞能量代謝相關因子活性的影響 單位：U/mg prot

由表2 可知，與常氧組相比，常氧+AC 組大鼠心肌細胞Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶的活性顯著升高（P＜0.05）；低氧組大鼠心肌細胞Na+-K+-ATP 酶活性顯著降低（P＜0.05）， Ca2+-ATP 酶活性極顯著降低（P＜0.01）。與低氧組相比，低氧+AC 組大鼠心肌細胞Na+-K+-ATP 酶、 Ca2+-ATP 酶活性均極顯著升高（P＜0.01）。

結(jié)果表明，低氧可抑制細胞內(nèi)Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性，黑果枸杞花青素可通過上調(diào)Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性改善低氧對H9c2 大鼠心肌細胞ATP 酶的損傷，并增強低氧下心肌細胞的能量代謝。

2.3 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞炎癥因子含量的影響（見表3）

表3 黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細胞炎癥因子含量的影響

由表3 可知，與常氧組相比，常氧+AC 組大鼠心肌細胞促炎因子TNF-α、IL-6 抗體含量均顯著降低（P＜0.05），抗炎因子IL-10 抗體含量極顯著升高（P＜0.01）；低氧組大鼠心肌細胞促炎因子TNF-α、IL-6抗體含量均極顯著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10 抗體含量極顯著降低（P＜0.01）。

與低氧組相比，低氧+AC 組大鼠心肌細胞促炎因子TNF-α、IL-6 抗體含量均極顯著降低，抗炎因子IL-10抗體含量極顯著升高（P＜0.01）。

結(jié)果表明，黑果枸杞花青素可通過抑制低氧誘導后的H9c2 大鼠心肌細胞中促炎因子TNF-α、IL-6 的分泌，促進抗炎因子IL-10 的分泌，抑制低氧誘導的炎癥的發(fā)生。

3 討論

3.1 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞抗氧化因子含量的影響

氧化應激是活性氧生成與抗氧化防御系統(tǒng)之間失衡的結(jié)果[7-8]，能夠?qū)е滦募〖毎麚p傷，從而引發(fā)心肌損傷性疾病[9-10]，影響機體能量代謝，引發(fā)炎癥反應。MDA、CAT、SOD、GSH-Px 是判斷機體氧化應激反應的重要指標，MDA 屬于機體氧化應激后的產(chǎn)物，間接反映心肌細胞氧化應激損傷程度[11]。CAT、SOD、GSH-Px 作為3 種內(nèi)源性抗氧化酶，可抑制機體內(nèi)自由基生成[12-14]，上調(diào)CAT、SOD、GSH-Px 氧化因子水平可緩解機體發(fā)生氧化應激后自由基的產(chǎn)生，提高清除自由基的能力，減少氧化應激對機體造成的損傷。HO-1是一種新發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，可以在氧化應激狀態(tài)下被誘導產(chǎn)生，在氧化應激狀態(tài)下，HO-1 高度表達可以保護機體免受損傷[15]。

本研究顯示，在常氧狀態(tài)下，加入黑果枸杞花青素，大鼠心肌細胞CAT、HO-1 活性均明顯升高，GSH-Px、SOD 活性均極顯著升高，MDA 的含量明顯降低，說明在常氧條件下，黑果枸杞花青素能夠提高心肌細胞抗氧化能力。與常氧相比，低氧狀態(tài)下心肌細胞內(nèi)GSH-Px、HO-1 活性均明顯降低，CAT、SOD 活性均極顯著降低，MDA 含量極顯著升高，說明低氧導致心肌細胞氧化應激損傷。而加入黑果枸杞花青素后，低氧組心肌細胞的CAT、GSH-Px、SOD、HO-1 活性均極顯著升高，MDA 含量極顯著降低。研究表明，黑果枸杞花青素能夠提高心肌細胞的抗氧化應激水平，減弱氧化應激造成的損傷。

3.2 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞能量代謝相關因子的影響

能量代謝作為機體正常生理活動的基本特征，是機體的一種新陳代謝方式[16]。然而，機體不能直接吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)中的能量，必須轉(zhuǎn)化成高能磷酸化合物ATP儲存在細胞中。當機體需要時，ATP 酶將ATP 催化水解成ADP 釋放出能量，為生理活動提供能量[17]。ATP 酶主要存在于組織細胞或細胞器內(nèi)膜上，保證細胞新陳代謝物質(zhì)進出，對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用，Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶作為細胞膜上最典型的蛋白酶，也是能量代謝水平的重要的指標。低氧狀態(tài)下，心肌細胞ATP 生成量減少，心肌細胞膜離子通道活動受到影響，導致細胞內(nèi)鈉離子增多。同時，Ca2+-ATP 酶活性受到抑制，使心肌細胞內(nèi)外鈣離子失衡，導致心肌損傷。因此，保持Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性能夠更好地維持細胞內(nèi)Na+、Ca2+細胞離子平衡，從而保護心臟，減輕心肌損傷[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，在常氧狀態(tài)下，加入黑果枸杞花青素后，心肌細胞的Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性明顯升高，說明在常氧下黑果枸杞花青素可以提高其能量代謝水平。與常氧相比，低氧狀態(tài)下心肌細胞的Na+-K+-ATP 酶活性明顯下降，Ca2+-ATP 酶活性極顯著下降，說明低氧導致心肌細胞能量代謝下降。加入黑果枸杞花青素能夠極顯著提高心肌細胞中的Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性。研究表明，黑果枸杞花青素能夠通過提高心肌細胞中Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性，增強低氧情況下心肌細胞能量代謝，維持細胞離子平衡，從而起到保護心肌的作用。

3.3 黑果枸杞花青素對H9c2 大鼠心肌細胞炎癥因子含量的影響

炎癥是機體對外界刺激的一種防御反應，但相應也會造成一定程度的自我損傷。機體受到氧化應激損傷，會增加炎性因子的產(chǎn)生[21]。由巨噬細胞和單核細胞分泌的TNF-α 是參與機體炎癥和免疫反應的重要的調(diào)節(jié)因子之一，可通過其他相關的細胞因子和增加血管通透性誘發(fā)局部炎癥反應[22]。IL-6 由心肌細胞自身產(chǎn)生[23]，能夠產(chǎn)生細胞毒性，直接損傷心肌細胞[24]。IL-10 是一種有效的抗炎細胞因子，產(chǎn)生于單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等細胞，可抑制促炎因子如TNF-α、IL-6 等的合成，發(fā)揮抗炎作用[25-26]。

本研究顯示，在常氧狀態(tài)下，加入黑果枸杞花青素，促炎因子TNF-α、IL-6 含量均明顯降低，IL-10含量極顯著升高，說明黑果枸杞花青素能夠提高心肌細胞抗炎能力。與常氧相比，低氧狀態(tài)下促炎因子TNF-α、IL-6 含量均極顯著升高，抗炎因子IL-10 含量極顯著降低，說明低氧導致心肌細胞產(chǎn)生炎性反應，抑制抗炎因子IL-10 分泌，減輕對促炎因子TNF-α、IL-6 的抑制作用。加入黑果枸杞花青素的低氧組中促炎因子TNF-α、IL-6 含量均極顯著降低，抗炎因子IL-10 含量極顯著升高。研究表明，黑果枸杞花青素能夠通過抑制心肌細胞中促炎因子TNF-α、IL-6 表達，促進抗炎因子IL-10 表達，降低低氧氧化應激所致細胞損傷的炎性反應。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，黑果枸杞花青素能夠通過提高CAT、GSH-Px、SOD、HO-1 活性，降低MDA 的含量提高H9c2 大鼠心肌細胞的抗氧化水平；通過提高Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性，增強低氧下心肌細胞的能量代謝；通過減少促炎因子TNF-α、IL-6 的含量，增加抗炎因子IL-10 含量，抑制低氧誘導的炎癥反應。

綜上所述，黑果枸杞花青素能夠緩解氧化應激所致的一系列損傷，對H9c2 大鼠心肌細胞具有保護作用，可為黑果枸杞花青素對心肌細胞氧化損傷的影響研究提供參考，同時也為開發(fā)青海省黑果枸杞作為新型植物源免疫增強劑提供參考。