趙轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 楊紅玲 趙 蕓 汪 攀， 朱傳忠 孫云章

（1．集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門市飼料檢測與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；2．福建大北農(nóng)華有水產(chǎn)科技集團(tuán)有限公司，福建 漳州 363500）

本課題組前期從石斑魚腸道篩選到一株益生菌——短小芽孢桿菌SE5，餌料中添加SE5（1.0×108CFU/g）能夠有效提高斜帶石斑魚飼料效率，改善免疫功能，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[7-8]。益生菌和益生元組合成的飼料添加劑為合生素，其功效往往優(yōu)于單獨(dú)添加益生元或益生菌[9-10]。丁酸是在腸道中存在的一種短鏈脂肪酸，可為腸上皮細(xì)胞生長發(fā)育直接供能，但丁酸半衰期很短，極易揮發(fā)，不適合在飼料中直接添加[11]。三丁酸甘油酯半衰期長，安全無毒副作用，被腸道胰脂肪酶水解后產(chǎn)生3個(gè)分子的丁酸，是動(dòng)物良好的丁酸來源。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同梯度果寡糖（FOS）能夠提高斜帶石斑魚的生長性能、免疫力和腸道健康[12-13]。本研究在此基礎(chǔ)上，探究不同梯度果寡糖添加短小芽孢桿菌（SE5）和三丁酸甘油酯（Tb）對斜帶石斑魚生長、免疫和腸道形態(tài)的影響，為復(fù)合添加劑的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斜帶石斑魚幼魚購自廈門小嶝島某石斑魚育苗場。FOS和Tb由江蘇易實(shí)生物科技有限公司提供。本試驗(yàn)以魚粉和豆粕為蛋白源，魚油和豆油為脂肪源，配制4 組等氮、等脂餌料。基礎(chǔ)餌料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)餌料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)） 單位：%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

正式試驗(yàn)前進(jìn)行10 d 的馴養(yǎng)，馴養(yǎng)期間從商品餌料過渡至基礎(chǔ)餌料，每天飽食投喂2 次（8：30、17：30）。馴養(yǎng)結(jié)束后選取300尾平均體重為（18.13±0.02） g的健康石斑魚，隨機(jī)分為4 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25 尾魚，置于75 cm×45 cm×50 cm 的玻璃水族缸進(jìn)行56 d 養(yǎng)殖試驗(yàn)。T1 組（對照組）斜帶石斑魚飼喂基礎(chǔ)餌料，T2 組、T3 組、T4 組在T1 組的基礎(chǔ)上分別添加0.05% FOS+SE5+0.10% Tb、0.10% FOS+SE5+0.10% Tb和0.20% FOS+SE5+0.10% Tb。將原料粉碎，過60 目篩，按照配方比例采用逐級(jí)擴(kuò)大法混勻。短小芽孢桿菌SE5添加量均為1×108CFU/g，均勻噴灑在已混勻的餌料原料中，使用雙螺桿制粒機(jī)制成直徑為2.5 mm的軟顆粒餌料，在室溫下風(fēng)干12 h，分裝于自封袋，置于4 ℃保存。

養(yǎng)殖用水為一級(jí)砂濾海水，試驗(yàn)期間水溫保持在25～29 ℃，pH值約為8，鹽度為24‰～30‰，連續(xù)24 h充氣，每日換水量為養(yǎng)殖水體的50%。

1.3 樣品采集

分別于試驗(yàn)第28、56 d對每個(gè)缸的魚計(jì)數(shù)，稱總重，統(tǒng)計(jì)各組魚的生長性能、餌料利用率和存活率。

于試驗(yàn)第28、56 d分別從每個(gè)缸中隨機(jī)撈取4尾魚，用40 mg/L 丁香酚麻醉，血樣取自尾靜脈，于1.5 mL 離心管保存，在4 ℃恒溫24 h離心（10 000 r/min、10 min）后收集血清。采集血液后，取出腸道，其中兩尾魚的腸道于-80 ℃冰箱保存，用于測定消化酶活性；另外2尾魚的前腸（2 cm左右）置于Bouin氏液中固定超過12 h，用于制作腸道切片。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

2.確定資金計(jì)劃管理的范圍。根據(jù)資金的經(jīng)營流程明確資金支出和收入的相關(guān)部門、團(tuán)隊(duì)。明確資金收入和支出類型。資金收入包括盈利收入、債務(wù)收入等，資金支出包括經(jīng)濟(jì)投資、友情投資等。企業(yè)將收入和支出情況作出詳細(xì)的分化。

根據(jù)公式計(jì)算增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、餌料系數(shù)（FCR）和存活率（SR）。

式中：W0為魚的初重（g）；Wf為魚末重（g）；FI為每尾魚餌料攝入總量（g）；T為飼養(yǎng)天數(shù)（d）；N0為初始魚尾數(shù)；Nf為最終魚尾數(shù)。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）的活性。

1.4.3 腸道消化酶活性

腸道樣品測定前經(jīng)4 ℃冰箱解凍，使用濾紙吸干表面水分，剪取腸道組織約0.1 g，加入9 倍體積的滅菌生理鹽水勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液保存。采用福林酚法測定蛋白酶活性，采用分光光度計(jì)法測定淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LPS）活性。

1.4.4 腸道形態(tài)觀察

固定在Bouin 氏液中的前腸經(jīng)一系列乙醇溶液脫水，使用二甲苯清除并嵌入石蠟中，切割為5 μm的切片，進(jìn)行HE染色，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量前腸絨毛高度、絨毛寬度、絨毛數(shù)量和肌層厚度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0 軟件中的單因素方差分析和Duncan's多重比較法檢驗(yàn)各組間差異，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚長性能的影響（見表2）

表2 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚生長性能的影響

由表2 可知，不同日糧飼喂的斜帶石斑魚餌料系數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)28 d，與T1組相比，T2組、T3組、T4組斜帶石斑魚末重、增重率、特定生長率均有提高，其中T3組增幅最大（P＞0.05）。試驗(yàn)56 d，T2組、T3組、T4組斜帶石斑魚末重、增重率、特定生長率均顯著高于T1組（P＜0.05），各組存活率均接近100%。

2.2 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚腸道消化酶活性的影響（見表3）

表3 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚腸道消化酶活性的影響

由表3 可知，試驗(yàn)28 d，與T1 組相比，T2 組、T3組、T4組斜帶石斑魚腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著升高（P＜0.05）；淀粉酶活性隨復(fù)合添加劑中果寡糖含量增加呈上升趨勢，與T1組相比，T4組斜帶石斑魚淀粉酶活性顯著升高（P＜0.05）。試驗(yàn)第56 d，與T1 組相比，T3 組、T4 組斜帶石斑魚蛋白酶和淀粉酶活性顯著升高（P＜0.05），T4 組斜帶石斑魚的脂肪酶活性顯著升高（P＜0.05）。

2.3 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚免疫指標(biāo)的影響（見表4）

表4 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚免疫指標(biāo)的影響

由表4 可知，試驗(yàn)28 d 時(shí)，與T1 組相比，T2 組、T3 組、T4 組斜帶石斑魚血清溶菌酶活性顯著升高（P＜0.05）。

試驗(yàn)28、56 d 時(shí)，與T1 組相比，T2 組、T3 組、T4組斜帶石斑魚血清超氧化物歧化酶活性均有升高，其中T3組和T4組顯著高于T1組（P＜0.05）；T3組斜帶石斑魚血清酸性磷酸酶活性最高，顯著高于T1組（P＜0.05）。

2.4 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚腸道組織形態(tài)的影響（見圖1～圖3）

圖1 復(fù)合添加劑對28 d時(shí)斜帶石斑魚腸道形態(tài)的影響（100×）

圖2 復(fù)合添加劑對56 d時(shí)斜帶石斑魚腸道形態(tài)的影響（100×）

圖3 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚腸道形態(tài)的影響

由圖1和圖2可知，各組石斑魚腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)都較為完整，絨毛排列整齊，與T1 組相比，T2 組、T3 組、T4組石斑魚腸絨毛高度、絨毛寬度、肌層厚度和絨毛數(shù)量均有所增加。

由圖3（a）可知，與對照組相比，T2 組、T3 組、T4 組石斑魚腸絨毛高度顯著增加（P＜0.05），T4 組顯著高于T2 組和T3 組（P＜0.05）。試驗(yàn)28 d 時(shí)，T2 組、T3 組、T4 組石斑魚腸絨毛寬度和肌層厚度顯著高于T1 組（P＜0.05），T4 組腸絨毛寬度顯著高于T3 組（P＜0.05）；T2 組和T3 組絨毛數(shù)量顯著高于T1 組（P＜0.05）。試驗(yàn)56 d 時(shí)，T2 組～T4 組石斑魚腸絨毛寬度和絨毛數(shù)量顯著高于T1組（P＜0.05）；T2組和T4組肌層厚度顯著高于T1組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚生長性能的影響

合生素由于結(jié)合了益生元和益生菌的積極作用，通常表現(xiàn)出更好的促生長作用[14]。研究表明，與單獨(dú)添加益生菌或益生元相比，日糧中添加合生素可使錦鯉（Cyprinuscarpio）[15]、奧尼羅非魚（Oreochromisniloticus♀×O.aureus♂）[16]、卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）[17]、日本鰻鱺（Anguillajaponica）[18]表現(xiàn)出更高的WGR。此外，三丁酸Tb可維持菊黃東方鲀（Takifuguflavidus）腸道微生物平衡[19]，增強(qiáng)建鯉（Cyprinuscarpiovar）腸道抗氧化能力[20]，從而促進(jìn)魚生長。本研究中，復(fù)合添加劑（FOS+SE5+Tb）飼養(yǎng)斜帶石斑魚56 d，顯著提高了斜帶石斑魚WGR和SGR，與Rodriguez-Estrada等[21]發(fā)現(xiàn)在餌料中添加甘露寡糖+糞腸球菌+聚羥基丁酸在虹鱒（Oncorhynchusmykiss）上的應(yīng)用結(jié)果一致。

腸道的消化和吸收能力對魚類生長具有重要作用[22]。消化酶活性尤其是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，與魚類的消化能力密切相關(guān)。張春暖等[15]研究發(fā)現(xiàn)，錦鯉餌料中添加0.3% FOS和1×107CFU/g德式乳酸菌可提高錦鯉腸道蛋白酶和脂肪酶活性。李富東[23]發(fā)現(xiàn)，將FOS 和克勞氏芽孢桿菌聯(lián)合添加到牙鲆（Paralichthysolivaceus）餌料中，牙鲆腸道蛋白酶和淀粉酶活性均有升高。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦餌料中聯(lián)合使用Tb 和FOS，其效果優(yōu)于單獨(dú)添加Tb。金子博[25]研究發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯和凝結(jié)芽孢桿菌在提升虎龍雜交斑（E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）腸道脂肪酶活性上具有協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)28 d時(shí)，T2組、T3組、T4組斜帶石斑魚腸道蛋白酶和脂肪酶活性顯著高于對照組，T4組腸道淀粉酶活性顯著高于對照組，試驗(yàn)56 d，T3組和T4組腸道蛋白酶和淀粉酶活性顯著高于對照組，表明復(fù)合添加劑（FOS+SE5+Tb）可提高斜帶石斑魚腸道消化酶活性，進(jìn)而改善生長性能。

3.2 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚血清免疫功能的影響

Tb可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫物質(zhì)的活性和提高抗氧化能力增強(qiáng)機(jī)體免疫力[26]。Cheng等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在餌料中添加Tb 可顯著改善草魚（Ctenopharyngodonidella）血清LZM 和SOD 活性。Liu 等[24]在高豆粕日糧中補(bǔ)充Tb，發(fā)現(xiàn)可顯著改善凡納濱對蝦血淋巴ACP 和AKP 活性。研究表明，F(xiàn)OS 和芽孢桿菌均可以通過抑制病原微生物、增強(qiáng)免疫力及水生動(dòng)物的疾病抵抗力[28-30]，并且FOS和芽孢桿菌具有協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用能夠更好地提高三角魴（Megalobramaterminalis）[30]、海參（Apostichopus japonicus）[31]和錦鯉[15]的免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚血清SOD、LZM活性顯著升高，表明復(fù)合添加劑有效增強(qiáng)了機(jī)體的免疫功能?？赡苁且?yàn)镕OS和Tb作為腸道微生態(tài)平衡的調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)腸道乳酸菌等有益菌的增殖[19,30]，而乳酸菌可以通過與病原菌競爭黏附位點(diǎn)增強(qiáng)宿主的免疫機(jī)能[32]。

3.3 復(fù)合添加劑對斜帶石斑魚腸道組織形態(tài)的影響

腸道既是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場所，也是抵御外部環(huán)境各種刺激的重要屏障[33-34]。研究表明，在餌料中補(bǔ)充Tb 能夠修復(fù)黑鯛（Acanthopagrusschlegelii）[35]和黃姑魚（Nibeaalbiflora）[36]高豆粕引起的腸道損傷，并維持腸道結(jié)構(gòu)的完整性。與單獨(dú)補(bǔ)充Tb 相比，Tb 和FOS 聯(lián)合使用可進(jìn)一步改善凡納濱對蝦腸絨毛高度[24]，Tb和甘露寡糖（MOS）聯(lián)合添加可有效提高菊黃東方鲀前腸和后腸絨毛高度和寬度[19]。肖世玖等[37]研究發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴餌料中補(bǔ)充合生素（地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和低聚木糖）能夠顯著提高絨毛高度。本研究發(fā)現(xiàn)，餌料中補(bǔ)充復(fù)合添加劑（FOS+SE5+Tb）可顯著提高斜帶石斑魚腸絨毛高度、絨毛寬度、絨毛數(shù)量和肌層厚度，以T4組效果較好。

4 結(jié)論

復(fù)合添加劑（FOS+SE5+Tb）能夠改善斜帶石斑魚的生長性能、免疫力以及腸道形態(tài)，且T4 組（0.2% FOS+1.0×108CFU/g SE5+0.1%Tb）效果較好。