劉 瑾 趙 華

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

丁酸梭菌屬于梭菌屬，是革蘭氏陽性菌中特有的腸道益生菌，具有較高的耐受性，菌體呈直桿狀或稍彎曲，被鞭毛包圍，是一種在惡劣環(huán)境中可通過形成芽孢增強(qiáng)自身對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)能力的菌株[1]。丁酸梭菌的芽孢抗逆性強(qiáng)，能夠經(jīng)受制備過程中高溫、干燥、酸堿性的侵蝕，還具有穩(wěn)定性強(qiáng)的特性[2]。芽孢在適當(dāng)?shù)臈l件下可重新萌芽并形成細(xì)菌。在腸道中，梭菌屬與乳酸菌屬等益生菌之間互利共生，可促進(jìn)乳酸菌屬等益生菌的生長(zhǎng)，達(dá)到調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡的作用[3]。

丁酸梭菌具有獨(dú)立的消化酶系統(tǒng)，可分泌多種代謝產(chǎn)物，其中丁酸是其最主要的代謝產(chǎn)物之一，可作為宿主胃腸道的能量來源[4]，促進(jìn)胃腸上皮組織發(fā)育并鞏固其屏障功能[5]，達(dá)到促生長(zhǎng)目的[6]。丁酸梭菌能夠產(chǎn)生較高濃度和純度的丁酸，具有較好的生長(zhǎng)穩(wěn)定性以及較低的營(yíng)養(yǎng)需求等優(yōu)點(diǎn)，極具開發(fā)潛力及商業(yè)價(jià)值[7]。近年來，丁酸梭菌作為益生菌被廣泛用于胃腸道疾病的臨床治療，如腸道菌群失調(diào)、藥物相關(guān)性腸炎、急性和慢性腹瀉、腸道應(yīng)激綜合征和便秘等，具有極強(qiáng)的腸道整理作用，對(duì)維持腸道正常生態(tài)有益；與其他益生菌制劑相比，丁酸梭菌的生長(zhǎng)速度快、抗應(yīng)激能力強(qiáng)、可以在腸道內(nèi)持續(xù)定植，能夠產(chǎn)生有機(jī)酸和丁酸梭菌肽[8-11]。丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)生的分泌物可調(diào)節(jié)體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和組成，改善動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)家畜生長(zhǎng)[12]。丁酸梭菌及其代謝產(chǎn)物具有提高動(dòng)物抗氧化能力、緩解炎癥、調(diào)節(jié)腸道免疫和屏障功能等作用[13-14]。這些特性使丁酸梭菌在食品、發(fā)酵工業(yè)、飼料、醫(yī)學(xué)醫(yī)藥等多個(gè)重要領(lǐng)域中具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[15-17]。

本研究從濃香型白酒窖泥中篩選丁酸梭菌，并對(duì)其進(jìn)行生理生化試驗(yàn)鑒定，采用氣相色譜法對(duì)其產(chǎn)酸量進(jìn)行檢測(cè)，為丁酸梭菌在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

窖泥樣品采自中國(guó)安徽文王酒業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥懸浮液的制備

稱取窖泥樣品3.0 g，加入盛有80 mL RCM培養(yǎng)基和20 個(gè)無菌玻璃珠（φ=3 mm） 的螺口瓶中，37 ℃、220 r/min 振蕩30 min，得窖泥懸浮液。將獲得的窖泥懸浮液置于80 ℃下加熱10 min，殺死營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，獲得僅含孢子的滅活窖泥懸浮液。

1.2.2 丁酸梭菌的篩選

將10%滅活窖泥懸浮液接種于300 mL RCM 培養(yǎng)基中，平行3 組。搖勻后，封口膜隔絕氧氣，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，觀察螺口瓶?jī)?nèi)產(chǎn)氣情況，選用產(chǎn)氣多的螺口瓶吸取5.0 mL加入裝有RCM培養(yǎng)基的螺口瓶?jī)?nèi)，重復(fù)上述步驟，富集培養(yǎng)4～5 次。吸取富集培養(yǎng)菌液100 μL涂布，封口膜隔絕氧氣，放入?yún)捬醮校?5 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。挑取單菌落三區(qū)劃線重復(fù)此步驟2～3 次，得到純化單菌落。顯微鏡下觀察菌體，將篩選出的細(xì)菌在4 ℃下保存。

1.2.3 篩選菌株的鑒定

1.2.3.1 菌落形態(tài)學(xué)觀察

點(diǎn)接單菌落于RCM 固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察記錄初篩菌的菌落形態(tài)、顏色、透明程度、光澤、大小等，分離純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.3.2 生理生化鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的方法對(duì)疑似菌株進(jìn)行相關(guān)生理生化鑒定。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析

（1）脫氧核糖核酸（DNA）提取。

將獲得的單菌接入RCM 液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d得到新鮮培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min收集菌體，使用1 mL RCM培養(yǎng)基重懸。

（2）PCR擴(kuò)增。

利用PCR 擴(kuò)增得到目的16S rDNA，將得到驗(yàn)證的PCR 產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序，選定目的菌株。引物為細(xì)菌通用引物，序列為27F（5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-ACGGTTACCTTG TTACGACTT-3'）。

PCR 擴(kuò)增體系：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL、27F 1 μL、1492R 1 μL、菌株培養(yǎng)液1 μL，加入ddH2O補(bǔ)至總體系25 μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。

取擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物3 μL，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，剩余PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃冰箱內(nèi)保存。若電泳驗(yàn)證獲得較好的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，則將剩余PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金維智生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，并通過NCBI 中的BLAST 數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選擇相似性較高的模式菌株序列。

1.2.4 測(cè)定篩選菌株生物學(xué)性能

1.2.4.1 菌株產(chǎn)酸量的測(cè)定

（1）酸類物質(zhì)的定性檢測(cè)。

分別吸取乙酸、丁酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mL于氣相色譜瓶?jī)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜分析條件見表1，獲得單獨(dú)短鏈脂肪酸（SCFAs）出峰保留時(shí)間。氣相色譜儀的配備為氫離子火焰檢測(cè)器（FID）、DB-FFAP（30 m×320 μm×0.5 μm）色譜柱。

表1 氣相色譜分析條件

（2）酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。

SCFAs 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度見表2，根據(jù)表2 配制SCFAs 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取酸類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，使用0.22 μm的有機(jī)相濾膜機(jī)型過濾，將溶液過濾至氣相色譜瓶?jī)?nèi)，按照表1方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得3種酸的氣相分析結(jié)果，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（g/L）X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到混合酸的各標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 SCFAs標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度 單位：g/L

（3）分析方法的精密度分析。

取表2內(nèi)濃度等級(jí)1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照表1的氣相分析條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣結(jié)束后為樣品換上未使用的氣相色譜瓶的螺口蓋，最終結(jié)果選擇以丁酸的峰面積作為酸的代表計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）用于表示分析測(cè)試結(jié)果的精密度。

式中：X為單次進(jìn)樣峰面積，μ為6次進(jìn)樣峰面積平均值，n為6次試驗(yàn)。

（4）培養(yǎng)液的前處理。

將篩選獲得的2 株單菌接種于RCM 固體培養(yǎng)基上，厭氧袋內(nèi)37 ℃培養(yǎng)3 d。使用接種環(huán)挑取少許菌落接種于300 mL RCM液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)6 d。

取菌體培養(yǎng)液1 mL，加入2%稀硫酸溶液，混勻，調(diào)節(jié)pH值為2，充分混勻完全酸化。用1 mL色譜純二氯甲烷1∶1 進(jìn)行萃取，萃取液用0.22 μm 濾膜過濾作為待測(cè)樣品。

（5）氣相色譜分析培養(yǎng)液的酸類物質(zhì)。

將單菌的培養(yǎng)液樣品前處理后，按照表1 進(jìn)行氣相色譜分析，利用混合酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量得到2 株單菌的產(chǎn)酸種類以及產(chǎn)量。

1.2.4.2 篩選菌株活菌數(shù)的測(cè)定

篩選菌株培養(yǎng)6 d 后測(cè)定其發(fā)酵液生物量OD600nm值判斷發(fā)酵液中菌株活菌數(shù)，3個(gè)平行，重復(fù)3次。

1.2.4.3 篩選菌株芽孢率的測(cè)定

將培養(yǎng)6 d的培養(yǎng)液80 ℃水浴10 min稀釋涂布于LB培養(yǎng)基，重復(fù)3次，計(jì)算芽孢率。

1.2.4.4 篩選菌株淀粉酶活性的測(cè)定

各取相同OD600nm值的1 mL發(fā)酵液滴加到淀粉瓊脂平板指定位置，厭氧培養(yǎng)72 h，在表面覆蓋一層碘液，觀察并測(cè)定透明圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥菌的篩選

利用RCM培養(yǎng)基從窖泥中共分離出15株菌落形態(tài)存在差異的單菌落，通過繼續(xù)培養(yǎng)篩選出2 株菌，其生長(zhǎng)發(fā)育較為穩(wěn)定，不易變性，命名為菌株J-1和菌株J-2。

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

將分離得到的菌株J-1、菌株J-2在RCM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)5～7 d觀察其菌落形態(tài)，對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并使用油鏡觀察，結(jié)果見圖1。

圖1 菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果（100×油鏡）

由圖1（a）、圖1（c）可知，菌株J-1分離后的菌落形態(tài)在RCM 平板培養(yǎng)基上皆呈現(xiàn)菌落大，白色不透明，中間深四周淺，菌落中心微微凸起，表面粗糙、扁平、不規(guī)則。

由圖1（b）、圖1（d）可知，菌株J-2為革蘭氏陽性菌，菌體呈現(xiàn)長(zhǎng)棒狀。

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果

對(duì)分離株進(jìn)行單糖分解試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表3。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌手冊(cè)》可初步判斷菌株J-1、菌株J-2均為丁酸梭菌。

表3 菌株生理生化鑒定結(jié)果

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將分離得到的菌株J-1、菌株J-2 在35 ℃的RCM 液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)2 d，得到新鮮菌體培養(yǎng)液，提取16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增結(jié)果在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行DNA驗(yàn)證，使用凝膠電泳成像系統(tǒng)得到的結(jié)果見圖2。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

由圖2 可知，篩選獲得的2 株單菌PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500～2 000 bp之間均出現(xiàn)了清晰且無彌散的條帶，表明得到了較高質(zhì)量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

將擴(kuò)增所得的產(chǎn)物送樣進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序完成后將菌株16S rDNA全序列基因組在NCBI中的BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)對(duì)比結(jié)果可知，菌株J-1 與酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）序列同源性為98.41%，菌株J-2 與酪丁酸梭菌序列同源性為98.32%，均與酪丁酸梭菌具有較高的親緣性。采用MEGA-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，根據(jù)NCBI 的比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹可知，菌株J-1、J-2 與酪丁酸梭菌有較高的親緣性，為梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）。

2.3 篩選菌株生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 菌株產(chǎn)酸量的測(cè)定結(jié)果

2.3.1.1 酸類物質(zhì)的定性檢測(cè)

根據(jù)步驟可得單獨(dú)酸類物質(zhì)的氣相定性分析結(jié)果，可知乙酸、丁酸、己酸的出峰保留時(shí)間分別為5.868、7.458、9.770 min。

混合酸的氣相分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，氣相分析圖清晰明了，峰形對(duì)稱性高，色譜圖峰形尖銳，且無雜質(zhì)峰干擾，物質(zhì)分離單一，可準(zhǔn)確定性，氣相分析方法分離快速、操作實(shí)用以及分析周期短。

圖4 混合酸的氣相分析結(jié)果

混合酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表4。由表4 可知，乙酸、丁酸、己酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明該氣相分析方法具有可靠性。

表4 混合酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)連續(xù)進(jìn)樣濃度等級(jí)1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液6次得到丁酸的色譜峰面積計(jì)算RSD，見表5。

根據(jù)RSD 計(jì)算公式可得，6 次連續(xù)進(jìn)樣，以丁酸為代表獲得RSD為0.185%。結(jié)果表明該氣相色譜分析方法精密度優(yōu)良。

2.3.1.2 菌株培養(yǎng)液中的酸種類及含量對(duì)比

將培養(yǎng)6 d的培養(yǎng)液通過前處理，并使用氣相進(jìn)行定性及定量分析，菌株產(chǎn)酸種類及產(chǎn)量見表6。

2.3.2 菌株生物學(xué)性能比較（見表7）

表7 菌株生物學(xué)性能比較

由表7可知，兩株菌的生物量無明顯差異，菌株J-1的生孢率比菌株J-2高17.16%，菌株J-1產(chǎn)生的淀粉酶活性高于菌株J-2。益生菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生的淀粉酶可將碳水化合物降解為低聚糖，促進(jìn)益生菌對(duì)碳源的利用。研究表明，菌株J-1生物學(xué)性能最優(yōu)。

3 討論

3.1 丁酸梭菌的分離、鑒定分析

丁酸可降低環(huán)境的pH值，改變菌群的生長(zhǎng)環(huán)境，影響其他菌群的生長(zhǎng)繁殖，維持腸道菌群的平衡，改善腸道消化吸收功能。目前，大部分丁酸梭菌分離自人的腸道和土壤，來自白酒窖泥中的丁酸梭菌較少。白酒釀造過程中丁酸梭菌的含量以及發(fā)酵分泌物可在一定程度上影響白酒風(fēng)味，將其應(yīng)用于飼料中不僅具備良好的整腸作用，還能夠起到一定的風(fēng)味調(diào)整作用，增強(qiáng)飼料的益生價(jià)值[18-20]。本研究從濃香型白酒窖泥中篩選出15 株形態(tài)各異的菌株，最終選擇兩株菌株，通過生理生化鑒定和16S rRNA測(cè)序比對(duì)，確定其為丁酸梭菌。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，兩株分離株與酪丁酸梭菌種屬關(guān)系最近。

3.2 丁酸梭菌產(chǎn)酸量分析

丁酸梭菌代謝產(chǎn)物中含有大量丁酸、乳酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)可促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌等益生菌生長(zhǎng)，抑制金黃色葡萄球菌、傷寒沙門桿菌、霍亂沙門桿菌等致病微生物的生長(zhǎng)，在動(dòng)物腸道中發(fā)揮巨大作用[21-22]。丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的丁酸、蛋白酶、維生素、抗菌肽物質(zhì)等物質(zhì)可提高機(jī)體的消化功能，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，清理腸道中的有毒物質(zhì)，提高腸道抗病能力[23]。本研究篩選得到的菌株J-1丁酸產(chǎn)量可達(dá)411.7 mg/L，為后續(xù)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件以提高丁酸產(chǎn)量提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.3 丁酸梭菌制劑的腸道益生性分析

目前，丁酸梭菌制劑被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中[24]。丁酸梭菌作為飼料添加劑，具有促進(jìn)機(jī)體腸道有益菌群增殖，抑制有害菌群生長(zhǎng)繁殖的保健功能，食用添加丁酸的飼料可使畜禽獲得更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并提高免疫力，為腸道上皮組織細(xì)胞的再生和修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力以及抗氧化等生物學(xué)功能[25-26]。丁酸梭菌在生長(zhǎng)過程可形成芽孢，在最終商品化的菌劑中，活菌大多以芽孢的形式存在，而非芽孢形態(tài)的菌制劑不具備耐藥性[27]。因此，提高丁酸梭菌在發(fā)酵過程中的菌體數(shù)量以及菌體形成芽孢的條件與配方進(jìn)行一系列研究對(duì)其在飼料中應(yīng)用具有重要意義。本研究中，菌株J-1 的生孢率為77.64%，可為后續(xù)提高生孢率提供參考

4 結(jié)論

本研究從窖泥中篩選獲得菌株J-1、菌株J-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定，確定菌株為丁酸梭菌。對(duì)兩株丁酸梭菌進(jìn)行生物學(xué)性能對(duì)比，菌株J-1在產(chǎn)酸種類及含量、活菌數(shù)、芽孢率、淀粉酶活性等方面均明顯優(yōu)于菌株J-2，可作為菌制劑儲(chǔ)備菌株。