孫 濤 陳李婷 鄧小紅 樊薈慧 陳 靜 賓石玉，3

（1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.廣西全州縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 桂林 541500；3.廣西師范大學(xué) 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006）

動(dòng)物腸道健康狀況與腸道菌群的穩(wěn)態(tài)關(guān)系密切，腸道菌群變化直接影響動(dòng)物腸道對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收與代謝，進(jìn)而影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能。與常規(guī)飼料相比，發(fā)酵飼料經(jīng)過(guò)微生物分解形成了豐富的次級(jí)代謝物，可以提高飼料利用率，具有降低畜禽疾病、提高免疫力、改善畜禽養(yǎng)殖環(huán)境等作用[1]。在豬[2]、蛋鴨[3]、肉雞[4]等畜禽中的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料能夠促進(jìn)腸道健康，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。中華圓田螺（Cipangopaludina cahayensis）俗稱田螺，是一種生活在淡水中的雜食軟體動(dòng)物，生長(zhǎng)繁殖迅速，尤其喜歡餌料豐富、土質(zhì)柔軟的稻田環(huán)境。田螺肉味道鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)及多種微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[5-6]，是我國(guó)稻田養(yǎng)殖的重要水產(chǎn)品種之一[7]。近年來(lái)，隨著稻螺綜合種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，僅靠稻田天然餌料養(yǎng)殖，田螺的養(yǎng)殖效益難以得到有效提升。因此，如何提高規(guī)?；B(yǎng)殖田螺的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量成為研究的熱點(diǎn)[8]。研究表明，以米糠為主要原料配制的發(fā)酵餌料能夠促進(jìn)田螺生長(zhǎng)，提高田螺養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[9]。但目前關(guān)于田螺發(fā)酵餌料的研究較少。本研究以中華圓田螺為研究對(duì)象，探討發(fā)酵餌料對(duì)其生長(zhǎng)和腸道菌群的影響，為田螺發(fā)酵餌料的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中華圓田螺由柳州市谷之韻農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司里提供，發(fā)酵菌液（植物乳酸桿菌、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌比例為1.5∶1.0∶1.0）由廣西科技大學(xué)提供。

發(fā)酵餌料配制：按照基礎(chǔ)餌料∶菌液比為5∶1將發(fā)酵菌液加入基礎(chǔ)餌料中，攪拌均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d，4 ℃冰箱保存。發(fā)酵餌料的有效活菌數(shù)為1.02×1011CFU/kg，基礎(chǔ)餌料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)餌料組成和營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)） 單位：%

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選擇約25 g 的中華圓田螺60 只，隨機(jī)分為2 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只螺。將田螺分別放入塑料養(yǎng)殖盆中，水量為浸沒(méi)過(guò)螺5 cm，保持25 ℃室溫。每天8：00、20：00 投喂餌料，投喂量為田螺體重的0.05%，每次投喂前用清水沖洗養(yǎng)殖盆，保持潔凈。A 組和B 組田螺分別飼喂基礎(chǔ)餌料和發(fā)酵餌料。試驗(yàn)期20 d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 樣品采集與處理

2.3.1 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道門水平相對(duì)豐度的影響（見(jiàn)表4）

在新一代技術(shù)融合圖書(shū)館服務(wù)的實(shí)踐中，手機(jī)技術(shù)是應(yīng)用廣泛而投入較小的。我團(tuán)隊(duì)于2016年與本地一家公司合作，圍繞紙質(zhì)圖書(shū)服務(wù)設(shè)計(jì)了10多種功能，實(shí)施效果良好?；诖耍擁?xiàng)目在2018年6月獲得了全國(guó)高校應(yīng)用案例二等獎(jiǎng)。

1.3.3.2 建庫(kù)測(cè)序

隨著電力系統(tǒng)日益龐大，邊界條件增多，運(yùn)行方式日趨復(fù)雜，其動(dòng)態(tài)運(yùn)行的非線性遞增，出現(xiàn)大停電的可能性在上升，應(yīng)該考慮大停電事件出現(xiàn)后的應(yīng)對(duì)措施。而大力發(fā)展分布式能源及能源互聯(lián)網(wǎng)是應(yīng)對(duì)大停電事件技術(shù)防范的重要舉措。當(dāng)然，還應(yīng)考慮停電時(shí)天然氣輸送系統(tǒng)的正常運(yùn)行和天然氣分布式能源黑啟動(dòng)的技術(shù)配備，真正起到應(yīng)急作用。

式中：W0為初重（g）；Wt為末重（g）；t為飼養(yǎng)天數(shù)（d）；Nt為終末只數(shù)；N0為初始只數(shù)；Wf為餌料攝入量（g）；Wp為餌料蛋白質(zhì)含量（%）。

1.3.3 高通量測(cè)序

1.3.3.1 樣品DNA提取

利用糞便DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，具體步驟參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)DNA的完整性、濃度和純度。

從表2可以看出，存在亞健康狀況的學(xué)生中膀胱能量阻滯的現(xiàn)象比較少見(jiàn)，主要存在的問(wèn)題是能量不足，其中男生11人，女生26人，占亞健康總?cè)藬?shù)的74%.膀胱能量不均衡的人容易出現(xiàn)背部疼痛、小便異常的現(xiàn)象，情況嚴(yán)重者還可能出現(xiàn)記憶力減退的狀況.

1.3.2 生長(zhǎng)性能

由表5可知，中華圓田螺腸道排名前5的菌屬為變形菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌屬、軟壁菌屬和衣原體。與A組相比，B組中華圓田螺豐度前5菌屬的相對(duì)豐度均有提高，其中厚壁菌屬和衣原體顯著提高（P＜0.05）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾、去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進(jìn)行OTU 劃分和物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和豐度情況，并作物種多樣性及組間差異分析。

財(cái)務(wù)預(yù)算管理的全面實(shí)施需要企業(yè)能夠制定出有效、詳細(xì)的可實(shí)施方案，方案中要包含具有的實(shí)施步驟以及相應(yīng)的考評(píng)機(jī)制，通過(guò)合理、科學(xué)的財(cái)務(wù)指標(biāo)對(duì)實(shí)施的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以此來(lái)確保預(yù)算的及時(shí)性和高效性。通過(guò)預(yù)算控制還能夠避免員工工作積極性不高的問(wèn)題，通過(guò)對(duì)國(guó)有企業(yè)所有管理者、員工進(jìn)行考評(píng)，從而來(lái)刺激其工作的積極性。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表2）

表2 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，兩組田螺的成活率均為100%。與A 組相比，B 組田螺的WGR、SGR 和PER 均有所提高，F(xiàn)CR降低（P＞0.05）。

2.2 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道內(nèi)容物測(cè)序序列及OTU的影響（見(jiàn)表3）

表3 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道內(nèi)容物測(cè)序序列及OTU的影響

由表3 可知，通過(guò)高通量測(cè)序得到有效序列共375 141 條，序列長(zhǎng)度范圍為416～455 bp。將有效序列進(jìn)行聚類并劃分，對(duì)OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)各組樣品的OTU覆蓋率均在99.9%以上，表明該測(cè)序能夠真實(shí)反映各組樣品的微生物組成。

2.3 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道菌群組成的影響

試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每個(gè)重復(fù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，統(tǒng)計(jì)餌料用量。每個(gè)重復(fù)田螺在無(wú)菌環(huán)境下解剖，取腸道內(nèi)容物置于無(wú)菌袋中，液氮中速凍，-80 ℃保存。

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束，統(tǒng)計(jì)田螺的數(shù)量及重量，計(jì)算增重率（WGR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）、餌料系數(shù)（FCR）、蛋白質(zhì)效率（PER）和成活率（SR）。

表4 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道門水平相對(duì)豐度的影響 單位：%

腸道微生物物種分析顯示，所有樣品中發(fā)現(xiàn)微生包含32個(gè)門、54個(gè)綱、142個(gè)目、214個(gè)科、397個(gè)屬。

快遞市場(chǎng)魚(yú)龍混雜，與快遞業(yè)法規(guī)建設(shè)和標(biāo)準(zhǔn)制定滯后有一定關(guān)系，雖然2008年國(guó)內(nèi)首個(gè)《中華人民共和國(guó)郵政行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》出臺(tái)，由于《標(biāo)準(zhǔn)》是推薦性的，并不具備法律強(qiáng)制力約束，多數(shù)快遞企業(yè)采取對(duì)其“視而不見(jiàn)”的態(tài)度，僅僅一部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，應(yīng)通過(guò)各種形式和各種方式向政府、人大及社會(huì)公眾發(fā)出建言建議，促使人大、政府出臺(tái)相關(guān)的實(shí)施細(xì)則等法律法規(guī)，進(jìn)一步規(guī)范和引導(dǎo)快遞行業(yè)。

由表4 可知，通過(guò)聚類分析及物種注釋發(fā)現(xiàn)，A 組、B組田螺腸道豐富度最高的前6個(gè)細(xì)菌門類依次為變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門，占總OTU 數(shù)的85%～89%。在門分類水平上，A 組、B 組田螺腸道菌門的相對(duì)豐富差異均不顯著（P＞0.05）。

煤礦業(yè)中使用防爆柴油機(jī)無(wú)軌膠輪車時(shí)，要進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗(yàn)。檢測(cè)項(xiàng)目要做到主次分明，有重要項(xiàng)目，有次要項(xiàng)目，要嚴(yán)格遵守檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，采用先進(jìn)儀器設(shè)備，針對(duì)重點(diǎn)項(xiàng)目細(xì)致檢測(cè)。另一方面，防爆柴油機(jī)無(wú)軌膠輪車的安全生產(chǎn)檢測(cè)，不僅能快速發(fā)現(xiàn)安全隱患，又能夠加強(qiáng)無(wú)軌膠輪車的運(yùn)輸監(jiān)管力度，預(yù)防危險(xiǎn)事故的發(fā)生。最后，開(kāi)展安全性能檢測(cè)，不僅可以預(yù)防煤礦業(yè)工程作業(yè)過(guò)程中出現(xiàn)意外事故，而且可以為實(shí)施單位帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益，發(fā)展前景良好。

2.3.2 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道屬水平相對(duì)豐度的影響（見(jiàn)表5）

表5 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道屬水平相對(duì)豐度的影響單位：%

提取樣品總DNA 后，根據(jù)16S rDNA V4-V5 區(qū)設(shè)計(jì)得到前端引物序列為-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，后端引物序列為-GGACTACNVGGGTWTCTAAT。在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用GeneTools AnalysisSoftware 對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500高能量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作在廣東美格基因科技有限公司完成。

能源供需情況：2020年、2025年和2030年的能源需求缺口分別為4 225萬(wàn)tce、6 615萬(wàn)tce和 10 215 萬(wàn)tce，能源缺口不斷增大。

2.4 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺對(duì)腸道菌群Alpha 多樣性的影響（見(jiàn)表6）

表6 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺對(duì)腸道菌群Alpha多樣性的影響

Chao1指數(shù)數(shù)值越大，物種越豐富；Simpson 數(shù)值越大，物種多樣性越高。

采用時(shí)長(zhǎng)T對(duì)機(jī)會(huì)通信產(chǎn)生的連續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行切片,生成一系列離散的拓?fù)淇煺請(qǐng)D,時(shí)長(zhǎng)T的大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度有很大的影響,T值的選取是切片的關(guān)鍵.

由表6 可知，B 組腸道菌群的OTU 數(shù)量、Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)均高于A 組（P＞0.05），表明投喂發(fā)酵餌料提高了中華圓田螺腸道微生物群落多樣性和豐度。

3 討論

3.1 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺生長(zhǎng)性能的影響

生長(zhǎng)性能是評(píng)價(jià)發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)狀況及經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)。研究表明，發(fā)酵飼料能夠提高飼糧的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善適口性，促進(jìn)動(dòng)物采食，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。原因是發(fā)酵過(guò)程中添加的菌種能夠改善動(dòng)物腸道菌群，且在代謝過(guò)程中產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等）[10-11]，可以改善餌料品質(zhì)，激活淀粉酶、蛋白酶等與碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的消化酶，加快魚(yú)、蝦對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[12-13]，進(jìn)而提高生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵餌料組中華圓田螺的WGR、SGR、PER 和FCR 均高于對(duì)照組，表明發(fā)酵餌料在一定程度上促進(jìn)了中華圓田螺的生長(zhǎng)。有研究表明，厚壁菌門在腸道中的主要作用是促進(jìn)碳水化合物和蛋白質(zhì)水解[14]，因此推測(cè)投喂發(fā)酵餌料提高了腸道中厚壁菌門微生物豐度，從而對(duì)營(yíng)養(yǎng)消化吸收具有一定的促進(jìn)作用，提高了田螺的生長(zhǎng)性能。

3.2 發(fā)酵餌料對(duì)中華圓田螺腸道菌群的影響

本研究對(duì)中華圓田螺腸道菌群的V4～V5 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，得到的序列片段長(zhǎng)度在416.28～454.99 bp 范圍內(nèi)，符合該區(qū)域的片段要求，并獲得大量有效信息序列；基于OTU在門水平的分類表明，中華圓田螺腸道菌群包含32 個(gè)門、54 個(gè)綱、142 個(gè)目、214 個(gè)科、397 個(gè)屬，其中豐富度最高的是變形菌門和擬桿菌門，結(jié)果與大部分水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物豐度相似。變形菌門是許多淡水及海水魚(yú)類腸道菌群中非常豐富的門[15]。鱘魚(yú)[15]的前腸道菌群中變形菌門豐度高達(dá)75%。牛蛙[16]腸道菌群中，梭桿菌門、厚壁菌門和變形菌門豐度占99%以上。日本沼蝦[17]的腸道微生物中變形菌門豐度最高，其次是厚壁菌門。日本鰻鱺[18]腸道中的變形菌門和厚壁菌門豐度最高。目前關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物腸道菌群的相關(guān)研究較少。本研究結(jié)果可為淡水螺類腸道微生物研究提供了一定參考，對(duì)田螺餌料開(kāi)發(fā)、飼養(yǎng)環(huán)境的選擇、消化病理研究具有一定的參考價(jià)值。

腸道菌群是數(shù)量和種類非常龐大的微生物群體，在維持正常的消化吸收、免疫防御等功能中具有重要作用。在具體功能上，有研究表明變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門能夠分泌促進(jìn)消化的酶[19]，放線菌能夠在一定程度上影響生物的生理與代謝[20-21]。而腸道菌群的相對(duì)豐度高則利于維持腸道微生物菌群穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)腸道健康，有利于提高生長(zhǎng)性能[13]。本研究中，與基礎(chǔ)餌料組相比，發(fā)酵餌料組的OTU 數(shù)目、Chao1 指數(shù)、Simpson指數(shù)均得到提高，表明發(fā)酵餌料更利于提高中華圓田螺的腸道微生物豐度，推測(cè)發(fā)酵餌料對(duì)促進(jìn)中華圓田螺腸道健康具有一定的積極作用；在兩組的豐度前5的細(xì)菌組成對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵餌料組中華圓田螺腸道中優(yōu)勢(shì)菌屬變形菌屬、擬桿菌屬、厚壁菌屬、軟壁菌屬和衣原體的相對(duì)豐度均提高，其中厚壁菌和衣原體顯著提高。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，與未發(fā)酵基礎(chǔ)餌料相對(duì)比，發(fā)酵餌料可以提高中華圓田螺的生長(zhǎng)性能、腸道微生物群落的多樣性和豐度。