穆玉敏，韓廣欣，張浩月，梁海龍，楊夢(mèng)茜，劉麗榮，任麗梅,2,3

（1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035；2.河北省生物制藥國(guó)際聯(lián)合研究中心，河北 石家莊 050035；3.河北省高效微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050035；4.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

0 引 言

R-3-氨基丁酸是醫(yī)藥中間體R-3- 氨基丁醇的前體。R-3-氨基丁醇則是合成抗艾滋病整合酶抑制劑杜魯特韋的重要原料。R-3-氨基丁酸還可以衍生為β-內(nèi)酰胺，進(jìn)而合成青霉烯類(lèi)抗生素。

杜魯特韋(Dolutegravir)作為葛蘭素史克旗下抗HIV 新藥，2013 年獲批FDA 上市并承認(rèn)了它的突破性。降低杜魯特韋原料藥成本、推廣其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵步驟是R-3-氨基丁酸。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016 年全球抗HIV 藥物銷(xiāo)售額為230.23 億美元，2011～2016 年復(fù)合增速為8.4%，顯著高于全球藥物市場(chǎng)約3.5%的平均增長(zhǎng)率。到2022 年市場(chǎng)價(jià)值增長(zhǎng)到320 億美元，R-3-氨基丁酸作為其重要原料中間體，其市場(chǎng)容量及價(jià)格也是水漲船高。

R-3-氨基丁酸為一種手性氨基醇類(lèi)，早期的氨基醇類(lèi)物質(zhì)主要通過(guò)天然的氨基酸為原料還原得到。目前，合成R-3-氨基丁醇的方法有以硼氫化物還原法、以酒石酸為拆分劑的拆分法和以釕碳等為誘導(dǎo)劑的化學(xué)誘導(dǎo)法等，近年興起以各種酶為核心的生物催化和基因轉(zhuǎn)移等合成方法。采用以上方法制備R-3-氨基丁醇的環(huán)境有不能直接獲得手性產(chǎn)物、污染大、收率不高且不利于企業(yè)的節(jié)能減排等缺點(diǎn)，生物法的相關(guān)產(chǎn)品研究逐步走向市場(chǎng)。為了降低杜魯特韋原料藥成本，推廣R-3-氨基丁醇應(yīng)用范圍，重要步驟在于開(kāi)發(fā)一種高效、低成本的路線(xiàn)合成高純度的R-3-氨基丁酸。

隨著科學(xué)研究進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)利用天冬氨酸酶突變體可以提供一種催化反式丁烯酸生產(chǎn)R-3-氨基丁酸的新路線(xiàn)。優(yōu)化其生產(chǎn)工藝達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)于生物醫(yī)藥行業(yè)具有重要的意義。該酶促體系由巴豆酸、銨鹽、含鎂離子的鹽組成，重組天冬氨酸酶突變體為生物酶催化劑，以氨水調(diào)節(jié)pH，在特定溫度及堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)分離、純化、脫色、過(guò)濾、結(jié)晶、干燥，獲得R-3-氨基丁酸。相對(duì)以上提及的化學(xué)法，生物催化具有環(huán)境友好、條件溫和、收率高、易制備和工藝路線(xiàn)短等優(yōu)點(diǎn)，可為杜魯特韋重要原料R-3-氨基丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的技術(shù)支撐。除此之外，與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，微生物合成技術(shù)是通過(guò)環(huán)境友好的途徑制備，免于使用重金屬、有機(jī)溶劑以及強(qiáng)酸強(qiáng)堿，且生物催化劑具有高效的底物特異性，可減少副產(chǎn)物的形成。R-3-氨基丁酸是一種典型的手性β 氨基酸，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)其有效組分僅為R 構(gòu)型。

本論文根據(jù)生物酶催化的高選擇性，針對(duì)生物催化結(jié)束后的反應(yīng)液以及終成品獲得前成分復(fù)雜的母液等進(jìn)行分析方法探討。生物酶催化原理：巴豆酸加銨鹽經(jīng)天冬氨酸酶催化，催化條件42 ℃pH 9.0，200 rpm 得到R-3-氨基丁酸。反應(yīng)液及母液等純化步驟為：催化反應(yīng)液—離心過(guò)濾—超濾—脫色（活性炭） —脫炭—減壓濃縮—結(jié)晶—離心洗滌—干燥—成品包裝。由生物酶催化原理和反應(yīng)液及母液等純化步驟可知，該反應(yīng)中間步驟包含銨根離子、鎂離子、原輔料雜質(zhì)、反應(yīng)雜質(zhì)等復(fù)雜組分。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于R-3-氨基丁酸含量測(cè)定方法主要為滴定法：精密稱(chēng)定R-3-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g 到250 mL 三角瓶中，加3 mL 無(wú)水甲酸待樣品完全溶解后繼續(xù)加入50 mL 冰醋酸，然后加兩滴結(jié)晶紫指示劑，立刻用高氯酸（已標(biāo)定） 滴定至紫色消失變?yōu)樗{(lán)色，保持30 s 不變色。R-3-氨基丁酸含量測(cè)定方法衍生法：采用1-氟-2,4-二硝基苯和HPLC 進(jìn)行衍生化，在360 nm 處進(jìn)行紫外檢測(cè)。R-3-氨基丁酸的相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)高效液相法：流動(dòng)相：準(zhǔn)確量取純水990 mL，甲醇10 mL 加入1 000 mL 量筒，加入0.5 mL 磷酸和1 mL 三乙胺調(diào)pH 為5.6，過(guò)濾超聲15 min 即得。稀釋液：超純水，色譜條件：色譜柱：YMC - Pack Pro C18 150×4.6 mml.D.S-3 μm；210 nm；流速：0.5 mL.min；波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間：30 min。上述3 種方法實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，且需結(jié)合不同方法定量檢測(cè)R-3-氨基丁酸及其相關(guān)物質(zhì)巴豆酸等，為解決現(xiàn)有方法存在的問(wèn)題，本文開(kāi)發(fā)了一種能夠快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)R-3-氨基丁酸及其相關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。通過(guò)50 mL 小體系反應(yīng)及1 L、30 L 體積放大反應(yīng)驗(yàn)證，在該方法條件下反應(yīng)底物巴豆酸在濃度0.05~0.4 g/L 范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，R2＞3 個(gè)9，產(chǎn)物R-3-氨基丁酸在濃度0.35~2 g/L 范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，R2＞3 個(gè)9，此方法同時(shí)滿(mǎn)足監(jiān)測(cè)催化反應(yīng)過(guò)程、原輔料及成品雜質(zhì)監(jiān)測(cè)，效率大大提升，該檢測(cè)法靈敏度高，檢測(cè)限為0.2 g/L，定量限0.5 g/L，對(duì)獲取高純度R-3-氨基丁酸有重大貢獻(xiàn)。

1 結(jié)果與討論

1.1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，LC-2030 Plus 島津。

電子天平，賽多利斯儀器有限公司型號(hào)AUW 220D。

pH 計(jì)，梅特勒- 托利多儀器有限公司，Seven2 Go S2。

1.1.2 材料與試劑

磷酸二氫鉀，分析純。

乙腈，色譜純。

磷酸阿拉丁色譜純含量≥85%。

超純水。

甲醇康科德，色譜純。

三乙胺色譜純含量≥99.5%。

R-3-氨基丁酸標(biāo)樣麥克林含量≥99.5%。

巴豆酸標(biāo)樣阿拉丁含量≥98%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 流動(dòng)相制備

流動(dòng)相一：準(zhǔn)確量取純水990 mL，甲醇10 mL加入1 000 mL 量筒，加入0.5 mL 磷酸和1 mL 三乙胺調(diào)pH 為5.6，過(guò)濾超聲15 min。

流動(dòng)相二：30 mM 磷酸二氫鉀加入超純水超聲至完全溶解，加5%乙腈，用磷酸調(diào)pH 為2.5，用0.45μm 有機(jī)膜過(guò)濾后超聲15 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：精準(zhǔn)稱(chēng)量0.1 g（精確至0.000 1 g） R-3-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解后定容至10 mL，震蕩混勻。分別吸取0.5、1、1.5 和2 mL 至10 mL 容量瓶，稀釋成0.5、1.0、1.5 和2.0 mg.mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g（精確至0.000 1 g） 巴豆酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水經(jīng)超聲波溶解后并定容至10 mL，振蕩混勻，用超純水按上述步驟將10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成0.05、1.0、2.0 和4.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.3 高效液相色譜分析條件

分析條件1：色譜柱:YMC - Pack Pro C18 150×4.6 mml.D.S-3 μm；流速：0.5 mL/min；波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間：30 min。

分析條件2：安捷倫Analytical 4.6×250 mm 5-Micron ；流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；采集時(shí)間：20 min。色譜操作條件為典型操作參數(shù)，依據(jù)儀器特點(diǎn)，可對(duì)操作參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以獲得最佳效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

分別用流動(dòng)相一、二對(duì)應(yīng)分析條件1、2，進(jìn)液相檢測(cè)R-3-氨基丁酸成品得到R-3-氨基丁酸及相關(guān)物質(zhì)色譜。色譜條件2 R-3-氨基丁酸如圖1 所示。

圖1 色譜條件2 R-3-氨基丁酸Fig.1 Chromatography condition 2 R-3-aminobutyric acid.

色譜條件1 R-3-氨基丁酸如圖2 所示。

圖2 色譜條件1 R-3-氨基丁酸Fig.2 Chromatography condition 1 R-3-aminobutyric acid

由圖1 和圖2 可以看出，兩個(gè)色譜條件檢測(cè)同一樣品R-3-氨基丁酸可得出結(jié)論。

（1） 液相色譜條件二基線(xiàn)相較平穩(wěn)。

（2） 液相色譜條件二靈敏度更高，可檢測(cè)其相關(guān)物質(zhì)更低檢出限，有利于工藝控制得到純度更高的產(chǎn)品。

（3） 液相色譜條件二相對(duì)時(shí)間較短，可提高檢測(cè)效率。

綜上特點(diǎn)色譜條件二可以同時(shí)完成原輔料、催化反應(yīng)、純化結(jié)晶和成品含量及雜質(zhì)分析，高效便捷。

2.2 檢出限和定量限及方法線(xiàn)性相關(guān)性的測(cè)定

分別以3 倍和10 倍信噪比濃度得到檢測(cè)限（LOD） 和定量限（LOQ），LOD 為0.15 mg/mL，LOQ 為0.5 mg/mL。配制R-3- 氨基丁酸和巴豆酸不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液4 個(gè)，在液相色譜條件二下， 分別進(jìn)行分析檢測(cè)，用質(zhì)量濃度做橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)得到線(xiàn)性回歸方程。線(xiàn)性關(guān)系測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系測(cè)試結(jié)果Table 1 Result of linear relationship test

如表1 在液相色譜條件二體系中，該反應(yīng)底物巴豆酸在濃度0.05~0.4 g/L 范圍線(xiàn)性良好，R2＞3個(gè)9，產(chǎn)物R-3-氨基丁酸在濃度0.35-2 g/L 范圍線(xiàn)性良好，R2＞3 個(gè)9，該液相色譜條件可滿(mǎn)足催化反應(yīng)至結(jié)晶過(guò)程含量及雜質(zhì)監(jiān)測(cè)，方便快捷。

2.3 方法精密度的測(cè)定

對(duì)同一樣品重復(fù)6 次，在液相色譜條件二體系中檢測(cè)，精密度測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度測(cè)試結(jié)果Table 2 Result of the precision test

準(zhǔn)偏差為8.9%；雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%；巴豆酸標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%；該液相色譜條件對(duì)各個(gè)重要物質(zhì)均能達(dá)到精密測(cè)定，重現(xiàn)性好。

3 展 望

R-3-氨基丁酸是抗艾滋病藥物杜魯特韋的重要原料，市場(chǎng)需求量與日俱增，本文主要對(duì)天冬氨酸酶生物催化反應(yīng)體系有關(guān)物質(zhì)開(kāi)展了一些研究，該工藝條件溫和、環(huán)境友好、工藝路線(xiàn)短、收率高、易制備、選擇性高，但該方法蛋白含量大，尤其全菌體系表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性，礙于時(shí)間受限，不完善之處，從以下幾個(gè)方面繼續(xù)探究。

（1） R-3-氨基丁酸UV 響應(yīng)值較低，檢出限相對(duì)較高，線(xiàn)性范圍較窄，巴豆酸UV 響應(yīng)值較高，線(xiàn)性范圍寬，合理稀釋倍數(shù)尤為重要。

（2） R-3-氨基丁酸與S-3-氨基丁酸形影不離，僅R-3-氨基丁酸為有意義活性，化工等其余領(lǐng)域是否直接高效生成R 構(gòu)型無(wú)法確定，本方法是否適用其體系有待研究。

（3） 本文涉及催化反應(yīng)底物較少蛋白較高體系，檢測(cè)前必需對(duì)樣品進(jìn)行高溫滅活及離心去除蛋白處理，用0.22μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾上機(jī)檢測(cè)，添加預(yù)柱以適當(dāng)保護(hù)色譜柱，需進(jìn)一步優(yōu)化上機(jī)檢測(cè)前處理手段。

4 結(jié) 語(yǔ)

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本方法可滿(mǎn)足生物轉(zhuǎn)化法體系R-3-氨基丁酸原輔料、催化反應(yīng)、純化結(jié)晶、成品含量同時(shí)檢測(cè)R-3-氨基丁酸及其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，線(xiàn)性回歸方程符合標(biāo)準(zhǔn)，基線(xiàn)平穩(wěn)、分離效果好、準(zhǔn)確度和精密度高、操作簡(jiǎn)單、快捷，是一種較為理想的HPLC 分析方法。

本文借助于生物轉(zhuǎn)化法高選擇性?xún)?yōu)點(diǎn)，生成高純度R-3-氨基丁酸技術(shù)日益成熟，本方法成本大大降低，且順應(yīng)我國(guó)環(huán)保發(fā)展趨勢(shì)，推廣此分析方法極具必要性。

本文方法已同時(shí)以實(shí)驗(yàn)級(jí)試劑和工業(yè)級(jí)試劑，在不同發(fā)酵體系和搖瓶催化及公斤級(jí)催化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在成品檢測(cè)中更體現(xiàn)出其有關(guān)物質(zhì)檢出限更低的優(yōu)勢(shì)，從而得到含量更高，純度更高成品。