高文雅 ，馮敏 ，高暢 ，趙海譽 ，周嚴(yán)嚴(yán) ，王宏潔 ，張麗麗 ，高彥青 ，肖艷紅 ，程翠娜 ，魏曉露 ，邊寶林 ，司南

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 2.葵花藥業(yè)集團（唐山）生物制藥有限公司，河北 唐山 064400

石菖蒲為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲Acortw tatarinowiiSchot的干燥根莖，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃功效[1]。揮發(fā)油是石菖蒲的主要有效成分，是石菖蒲質(zhì)量評價的重要指標(biāo)[2]。開心散始載于《備急千金要方》，由遠志、人參、茯苓、石菖蒲組成，有安神、補氣、利濕化濁功效，目前臨床常用于阿爾茨海默病、血管性癡呆等以記憶功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病[3]。石菖蒲作為開心散的主要成分，占處方藥量的32.5%。α-細辛腦是石菖蒲的主要揮發(fā)油成分，具有利膽、降血脂、解痙平喘、止咳祛痰等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，α-細辛腦能顯著改善帕金森模型小鼠[5]及癡呆模型小鼠[6]的行為缺陷[7-8]?？刂痞?細辛腦含量對石菖蒲藥材、飲片及其相關(guān)制劑均有重要作用。2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）僅用揮發(fā)油含量控制石菖蒲的質(zhì)量，未對其中的有效成分進行精準(zhǔn)的控制。本研究運用HPLC建立石菖蒲藥材、飲片及經(jīng)典名方開心散中α-細辛腦的含量測定方法，對15批不同產(chǎn)地石菖蒲藥材、飲片及開心散樣品進行檢測，同時考察α-細辛腦在藥材→飲片→開心散樣品間的量值傳遞關(guān)系，進一步完善復(fù)方制劑開心散的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀，日本島津公司；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；CP423C型電子天平，奧斯豪儀器（上海）有限公司；XA105型十萬分之一、ML-104T/02型萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

α-細辛腦對照品（批號100298-201203，純度99%，中國食品藥品檢定研究院）。色譜級乙腈、甲醇，質(zhì)譜級甲酸，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；娃哈哈純凈水。人參、遠志、茯苓、石菖蒲藥材及飲片，葵花藥業(yè)集團（唐山）生物制藥有限公司提供，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮主管藥師鑒定，分別為五加科植物人參Panax ginsengC. A. Mey.的干燥根和根莖、遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核、天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott的干燥根莖，符合2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定。15批石菖蒲藥材及飲片產(chǎn)地信息見表1。

表1 15批石菖蒲藥材及飲片產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

YMC Hydrosphere C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（44∶56），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長325 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 開心散樣品人參、遠志、石菖蒲和茯苓分別粉碎過篩后，按1∶1∶25∶50比例混合均勻，即得。

2.2.2 對照品溶液

取α-細辛腦對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。

2.2.3 石菖蒲藥材及飲片供試品溶液

石菖蒲粉碎后過3號篩，精密稱取石菖蒲粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理1 h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 開心散供試品溶液

精密稱取開心散粉末1.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率 40 kHz）處理l h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 石菖蒲藥材含量測定

2.3.1 空白試驗

石菖蒲藥材樣品色譜圖中的被測峰與對照品α-細辛腦的出峰時間及紫外圖譜均相同，在此色譜條件下甲醇溶劑無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察

取α-細辛腦對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含α-細辛腦0.197 mg的溶液。精密吸取1、2、4、6、8 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，每個濃度連續(xù)進樣3次，測定峰面積，以對照品進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得α-細辛腦回歸方程Y=2×107X-2 707.9，R2=1。結(jié)果表明，α-細辛腦在0.197～3.936 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗

取石菖蒲藥材（批號YFT003001810008），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)測定6次峰面積，結(jié)果RSD=0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取石菖蒲藥材（批號YFT003001810008）樣品6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積，結(jié)果RSD=1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.4”項下供試品溶液，室溫放置，分別于制備后0、4、6、13、28、47、69、105 h進樣，測定峰面積。α-細辛腦峰面積RSD=0.7%，表明樣品溶液中被測成分的含量至少在105 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

稱取已知含量的石菖蒲藥材（ 批號YFT003001810008）樣品0.25 g，共6份，精密稱定。根據(jù)重復(fù)性試驗結(jié)果，藥材中被檢測成分α-細辛腦含量0.2%，配制每毫升含α-細辛腦0.02 mg的甲醇溶液作為加樣液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進行測定。α-細辛腦平均回收率為96.2%，RSD=1.0%，回收率符合含量測定要求。

2.3.7 樣品含量測定

按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件，測定15批石菖蒲藥材樣品中α-細辛腦含量。色譜圖見圖1。采用2020年版《中國藥典》（四部）通則0832第四法（甲苯法）測定15批石菖蒲藥材水分。干燥品中α-細辛腦含量=樣品中α-細辛腦含量÷（1-水分%）。結(jié)果見表2。按干燥品計算，石菖蒲藥材中α-細辛腦的含量高于0.03%。

圖1 石菖蒲藥材、飲片及開心散中α-細辛腦HPLC圖

表2 15批石菖蒲藥材α-細辛腦含量測定結(jié)果（%）

2.4 石菖蒲飲片含量測定

2.4.1 空白試驗

同“2.3.1”項。

2.4.2 線性關(guān)系考察

同“2.3.2”項。

2.4.3 精密度試驗

取石菖蒲飲片（批號YF181008Q），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)測定6次峰面積，結(jié)果RSD=0.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗

取石菖蒲飲片（批號YF181008Q）樣品6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積，結(jié)果RSD=0.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.4.4”項下重復(fù)性供試品，室溫放置，分別于制備后0、4、6、13、28、47、69、105 h進樣，測定峰面積。α-細辛腦峰面積RSD=0.6%，表明樣品溶液中被測成分的含量至少在105 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗

稱取已知含量的石菖蒲飲片（批號YF181008Q）樣品0.25 g，共6份，精密稱定，配制每毫升含α-細辛腦0.02 mg的甲醇溶液作為加樣液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液并測定。結(jié)果α-細辛腦平均回收率為97.4%，RSD=0.5%，符合含量測定的要求。

2.4.7 樣品含量測定

按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，計算α-細辛腦含量。按“2.3.7”項下方法測定15批石菖蒲飲片水分，并計算干燥品中α-細辛腦含量，結(jié)果見表3。按干燥品計算，石菖蒲飲片中α-細辛腦的含量高于0.02%。

表3 15批石菖蒲飲片α-細辛腦含量測定結(jié)果（%）

2.5 開心散樣品含量測定

2.5.1 空白試驗

開心散樣品色譜圖中的被測峰與對照品的出峰時間相同，且開心散樣品色譜圖中被測峰與對照品色譜峰紫外圖譜相同。按“2.2.1”項下方法制備石菖蒲陰性制劑，并按“2.2.4”項下方法制成石菖蒲陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下陰性對照無干擾。

2.5.2 線性關(guān)系考察

同“2.3.2”項。

2.5.3 精密度試驗

取開心散樣品（批號KXS-01），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件連續(xù)測定6次，結(jié)果峰面積RSD=0.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗

取開心散樣品（批號KXS-01）樣品6份，制備供試品溶液，并按“2.1”項下條件測定，結(jié)果峰面積RSD=0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.5.4”項下重復(fù)性供試品，室溫放置，分別于0、4、6、13、28、47、69 h進樣，按“2.1”項下條件測定峰面積，α-細辛腦峰面積RSD=0.5%，表明樣品溶液中α-細辛腦在69 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗

稱取已知含量的開心散樣品（批號KXS-01）樣品0.75 g，共6份，精密稱定。根據(jù)重復(fù)性試驗結(jié)果，藥材中被檢測成分α-細辛腦含量0.205%，配制每毫升含α-細辛腦0.02 mg的甲醇溶液作為加樣液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定。結(jié)果α-細辛腦的平均回收率為96.97%，RSD=1.2%，符合含量測定的要求。

2.5.7 樣品含量測定

按上述方法測定15批開心散樣品中α-細辛腦含量，按“2.3.7”項下方法測定樣品中水分，并計算干燥品中α-細辛腦含量，結(jié)果見表4。按干燥品計算，開心散樣品中含α-細辛腦不少于0.010%。

表4 15批開心散樣品α-細辛腦含量測定結(jié)果（%）

2.6 混批藥材-飲片-開心散樣品含量對應(yīng)關(guān)系

將15批遠志、人參、茯苓、石菖蒲飲片分別進行混批后，測定混批藥材和飲片的α-細辛腦含量。飲片粉末按樣品制備方法制成開心散樣品，平行配制3份，測定樣品α-細辛腦含量，考察藥材-飲片-樣品間的質(zhì)量傳遞關(guān)系，結(jié)果見表5。混批藥材到飲片α-細辛腦的轉(zhuǎn)移率為109.01%，飲片配制成樣品后α-細辛腦的轉(zhuǎn)移率為104.45%，均在70%～130%范圍內(nèi)。

表5 混批藥材-飲片-開心散樣品α-細辛腦質(zhì)量傳遞結(jié)果

3 討論

經(jīng)前期試驗發(fā)現(xiàn)，細辛腦類成分超聲提取優(yōu)于回流提取，以甲醇為溶劑提取效果較好。對不同加液倍數(shù)（25、50、125倍）和超聲時間（30、45、60 min）進行比較，最終確定供試品提取方法為加50倍量甲醇超聲提取60 min。

本試驗考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水不同流動相比例方法，分別嘗試YMC Trait、YMC Hydrosphere、SilGreen C18色譜柱，對樣品進行色譜條件的摸索。結(jié)果在柱溫30 ℃、流動相為乙腈-水（44∶56）、流速1 mL/min條件下，各色譜柱均能相對較好地分離。α-細辛腦最大吸收波長257 nm，但是在該吸收波長下細辛腦類物質(zhì)比較復(fù)雜，不易進行有效分離。經(jīng)過6根不同廠家不同色譜柱的預(yù)試，與雜質(zhì)峰的最大分離度僅為1.6左右，雖然符合《中國藥典》規(guī)定，但系統(tǒng)適用性不佳。比較波長257、311、325 nm的含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一樣品在不同吸光度下測定的含量基本相同，且波長325 nm處雜質(zhì)峰無吸收。因此，α-細辛腦含量測定選用325 nm波長。

在15批藥材-飲片質(zhì)量傳遞研究過程中發(fā)現(xiàn)，理論認(rèn)為藥材經(jīng)加工成飲片后，α-細辛腦由于具有揮發(fā)性，其含量不應(yīng)高于原藥材。而根據(jù)測定的結(jié)果，石菖蒲飲片中的α-細辛腦含量變化趨勢不統(tǒng)一，其中4批不在70%～130%可接受范圍內(nèi)。進一步對液相圖譜進行比較，以及對生產(chǎn)加工及檢測流程進行深入思考，認(rèn)為造成這種情況的原因比較復(fù)雜，排除藥材-飲片之間是否嚴(yán)格遵守一一對應(yīng)及不可避免的人為失誤等，其原因可能有：①檢測取樣均勻性。在大宗藥材中取少量進行測定，雖然進行了混合和重復(fù)，卻仍存在一定隨機性，尤其是根莖、枝狀藥材，更容易存在這樣的問題。在20 kg藥材中僅取出一部分（500 g）藥材粉碎檢測后，另取一部分（2 kg）做成飲片，所檢測藥材只能象征性代表大宗藥材總體質(zhì)量，制得的飲片也不能完全代表大宗藥材，由于取樣不均勻，造成藥材→飲片成分傳遞間的不對應(yīng)性。②飲片制備過程中的不穩(wěn)定性。在飲片操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制相關(guān)參數(shù)，如潤濕、干燥時間、溫度等，以保證飲片質(zhì)量。根據(jù)15批藥材→飲片→樣品間的質(zhì)量傳遞結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)存在一部分逸出值，經(jīng)過分析和討論，認(rèn)為由于取樣不均勻造成此問題的可能性最大。因此進行混批后同時測定，研究其傳遞問題。排除該影響后，質(zhì)量可以較好傳遞，無逸出。