侯孜明 ，吳昊 ，馮佳 洪嵐 ，張宗星 ，劉道忠 ，江露 ，袁林

1.湖北民族大學(xué)風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；

2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000； 3.湖北恩施學(xué)院，湖北 恩施 445000

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年肺癌約占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的18%[1]。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），其中NSCLC占80%～85%。西醫(yī)主要采用放療、化療、靶向治療和免疫治療，但患者的五年生存率僅15%左右，且治療伴有嚴(yán)重不良反應(yīng)，包括腎毒性、骨髓抑制及胃腸道反應(yīng)，給患者帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)和痛苦[2-3]。因此，探索治療NSCLC的新藥物具有重要意義。

中藥對多種疾病具有良好的治療效果，能通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用。《中國植物志》記載楓楊屬Pterocarya Kunth植物包括湖北楓楊、楓楊、越南楓楊、水胡桃、華西楓楊、甘肅楓楊、云南楓楊7種[4]，其中湖北楓楊、華西楓楊、甘肅楓楊和云南楓楊為我國特有。楓楊中含有豐富的黃酮類化合物[5]。藥理研究表明，楓楊具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤等作用[6-8]。本研究觀察湖北楓楊總黃酮對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為NSCLC治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。采用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物及制備

本研究使用楓楊樹皮采于湖北省恩施州，經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院李厚聰老師鑒定為湖北楓楊Pterocarya hupehensisSkan的干燥樹皮。采用超聲輔助提取總黃酮，D101大孔樹脂分離純化，獲得純化的湖北楓楊總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測得總黃酮純度為78%。先用DMSO 溶解，使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋（DMSO終濃度不超過0.1%）。

1.3 主要試劑及儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號8121319），美國Gibco公司；胎牛血清（批號2140301），上海逍鵬生物科技有限公司；青鏈霉素（批號1857816），美國Gibco公司；CCK-8 試劑盒（批號NQ646），日本同仁公司；DMSO（批號RNBJ9551），美國Sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號2012008），廣州碩譜生物科技有限公司；D-101大孔吸附樹脂（批號20200916），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PMSF 蛋白酶抑制劑（批號101321211021），碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液（批號CR2107001），武漢塞維爾生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒（批號分別為A10523、A10431），杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；預(yù)染蛋白Marker（批號01081673），美國Thermo 公司；PVDF 膜、ECL 發(fā)光液（批號分別為R1BB06918、2106001），美國Millipore 公司；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（批號MA0383-Nov-01G），大連美侖生物；Fas、Bax、Bcl-2、Cyclin D1、P27抗體（批號分別為0200390102、3560005119、3560219203、0003210101、4000000455），武漢愛博泰克生物科技有限公司；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、β-actin抗體（批 號 分 別 為20000311、20000275、10004156），Proteintech 公司；Cleaved Caspase-3 抗體（批號15z0096），維百奧（北京）生物科技有限公司。

IX73 型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），F(xiàn)D8-8真空冷凍干燥機(jī)（瑞士Buchi公司），TH-100BQX數(shù)控超聲儀（美國GOLO-SIM公司），311 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ImageQuant LAS4000mini 生物分子成像儀（日本GE公司），Multiscan Go酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），SH800流式細(xì)胞分選儀（日本SONY公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后用RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入0（對照組）、25、50、100、150、200 μg/mL湖北楓楊總黃酮，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白組調(diào)零，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，每孔加入CCK-8工作液10 μL，放入培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀波長450 nm測定各孔吸光度（A值），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）÷（對照組A值-空白組A值）×100%。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測

將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，預(yù)冷PBS 洗滌，收集細(xì)胞，加入1×binding buffer 500 μL 重懸細(xì)胞，每個(gè)樣本分別加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL，渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

2.3 細(xì)胞周期檢測

將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌，預(yù)冷無水乙醇-20 ℃固定過夜，將固定細(xì)胞洗滌、沉淀后，加入DNA 染色液1 mL，渦旋振蕩5～10 s混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

2.4 Western blot檢測

將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解，BCA法測定蛋白濃度并加熱使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次（5 min/次），分別加入Fas、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cyclin D1、P27 一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，多功能凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 湖北楓楊總黃酮對A549細(xì)胞存活率的影響

與對照組（0 μg/mL）比較，不同濃度（25、50、100、150、200 μg/mL）湖北楓楊總黃酮處理細(xì)胞24、48 h對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果見圖1。為避免藥物毒性對細(xì)胞的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以100、150、200 μg/mL楓楊總黃酮作為低、中、高劑量處理A549細(xì)胞，作用時(shí)間24 h。

圖1 不同濃度湖北楓楊總黃酮對A549細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

4.2 湖北楓楊總黃酮對A549細(xì)胞形態(tài)的影響

對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，存活細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間隙較小、連接緊密，少見漂浮細(xì)胞；楓楊總黃酮各劑量組存活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列松散，間隙明顯增寬，培養(yǎng)基中可見大量漂浮細(xì)胞，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞狀態(tài)變差更為明顯。見圖2。

圖2 各組A549細(xì)胞形態(tài)（×400）

4.3 湖北楓楊總黃酮對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，楓楊總黃酮各劑量組A549細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見表1、圖3。

表1 各組A549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表1 各組A549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與對照組比較，**P＜0.01

凋亡率1.38±0.39 21.74±0.73**30.03±0.25**39.39±0.34**組別對照組楓楊總黃酮低劑量組楓楊總黃酮中劑量組楓楊總黃酮高劑量組n 3 3 3 3

圖3 各組A549細(xì)胞凋亡檢測流式圖

4.4 湖北楓楊總黃酮對A549細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，楓楊總黃酮各劑量組A549細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加（P＜0.01），S期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01）。見表2。

表2 各組A549細(xì)胞周期比較（±s，%）

表2 各組A549細(xì)胞周期比較（±s，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對照組楓楊總黃酮低劑量組楓楊總黃酮中劑量組楓楊總黃酮高劑量組G2/M期12.19±1.69 12.11±1.79 10.13±2.19 8.28±1.05*n 3 3 3 3 G0/G1期56.62±1.56 62.28±0.87**67.74±1.49**73.13±1.92**S期31.19±1.86 25.64±1.20**22.13±0.71**18.60±0.89**

4.5 湖北楓楊總黃酮對A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，楓楊總黃酮各劑量組細(xì)胞Fas、Bax、Cleaved Caspase-3、P27蛋白表達(dá)明顯升高，Cyclin D1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），楓楊總黃酮中、高劑量組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組A549細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）

5 討論

細(xì)胞增殖和凋亡失調(diào)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長發(fā)育中起重要作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為癌癥治療的一種策略[9-10]。細(xì)胞凋亡主要存在內(nèi)在（線粒體）途徑和外在死亡受體途徑[11]。Bcl-2家族蛋白是內(nèi)在途徑的中心調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)cyt-c和其他凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變線粒體膜通透性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[12-13]，主要由促凋亡蛋白（如Bax）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2）組成，Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平是決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡途徑的關(guān)鍵因素[14-15]；在外源性死亡受體通路中，F(xiàn)as是一種細(xì)胞表面蛋白，是重要的死亡受體之一[16]，通過與抗體或Fas配體（FasL）交聯(lián)可介導(dǎo)快速凋亡[17]。有研究表明，F(xiàn)as在包括肺癌在內(nèi)的各種癌癥中表達(dá)下調(diào)[18]。以上2種途徑最終會(huì)導(dǎo)致Caspase家族蛋白激活，特別是作為關(guān)鍵效應(yīng)因子的Caspase-3[19]。在正常情況下，Caspase-3以無活性前體存在于細(xì)胞中，在應(yīng)激條件下被切割以產(chǎn)生介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性片段，Caspase-3激活是細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡階段的標(biāo)志[20-22]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測楓楊總黃酮對A549細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且可以上調(diào)死亡受體蛋白Fas、促凋亡蛋白Bax表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3活化，上調(diào)Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。提示湖北楓楊總黃酮可能通過激活內(nèi)在途徑和外在途徑促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

除細(xì)胞凋亡外，細(xì)胞周期停滯是抑制癌細(xì)胞增殖的另一作用機(jī)制[23]。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，主要由細(xì)胞周期蛋白Cyclins、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cdks）及Cdks抑制劑共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。Cdks本質(zhì)上是無活性的催化亞基，需要與激活伴侶細(xì)胞周期蛋白（關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)亞基）結(jié)合，形成Cyclin-Cdk復(fù)合物以發(fā)揮在細(xì)胞增殖中的作用。另外，Cyclin-Cdk復(fù)合物可以與Cdks抑制劑結(jié)合，從而抑制激酶活性并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程[24-25]。因此，細(xì)胞周期受特定周期相關(guān)蛋白的正向調(diào)節(jié)，并受某些Cdks抑制因子的負(fù)向調(diào)節(jié)。Cyclin D1是調(diào)節(jié)G1期最重要的蛋白，P27是一種Cdks抑制劑，主要抑制從G1期到S期轉(zhuǎn)變的Cdks[26-27]。本研究結(jié)果表明，湖北楓楊總黃酮可以調(diào)節(jié)A549細(xì)胞Cyclin D1和P27蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞G0/G1期阻滯，即湖北楓楊總黃酮作用A549細(xì)胞后可能干擾DNA的合成，并可能在此階段抑制A549細(xì)胞增殖。

綜上所述，湖北楓楊總黃酮能抑制A549細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與激活線粒體和Fas介導(dǎo)的死亡受體通路以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、促進(jìn)A549細(xì)胞G0/G1期阻滯有關(guān)。