張丞波 ，王新東，

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028；

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

隨著急診經(jīng)皮冠脈介入血運(yùn)重建治療的積極開展和規(guī)范化藥物治療的認(rèn)真貫徹，急性心肌梗死（AMI）的即刻死亡率明顯下降。然而開通閉塞血管恢復(fù)血流的同時(shí)可導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷，并伴有心律失常、心肌壞死和細(xì)胞凋亡。缺血再灌注損傷對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、壞死等細(xì)胞的影響決定了心肌梗死的遠(yuǎn)期預(yù)后。越來(lái)越多的證據(jù)表明，壞死性凋亡可加重心肌梗死和缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展[1-2]，在缺血/再灌注損傷期間的細(xì)胞死亡中起重要作用[3]。

壞死性凋亡是細(xì)胞程序性死亡的途徑之一，激活RIPK1/RIPK3/MLKL通路可誘導(dǎo)壞死性凋亡[4]。抑制受體相互作用蛋白（RIP）1可減小梗死面積[5]，RIP3在心肌細(xì)胞中表達(dá)并與線粒體共定位，介導(dǎo)心肌梗死后的炎癥、活性氧生成和不良心臟重塑[6]。因此，壞死性凋亡通路可作為改善心室功能和縮小心肌梗死面積的靶點(diǎn)。鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制[7]，鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）Ⅱ在心肌組織中表達(dá)豐富，主要亞型為CaMKⅡδ。CaMKⅡ參與多種程序性細(xì)胞死亡途徑的調(diào)節(jié)[8]，包括壞死性凋亡，并且由RIP3 介導(dǎo)[9]。可見CaMKⅡ、RIPK1/RIPK3/MLKL通路與壞死性凋亡存在串話關(guān)系。

益氣活血法是冠心病的經(jīng)典治法[10-11]。補(bǔ)氣藥黃芪和活血藥丹參的配伍應(yīng)用是益氣活血法的代表藥對(duì)，具有抗心肌缺血性重構(gòu)及調(diào)控Ca2+通道等效應(yīng)[12-15]。前期研究表明，黃芪-丹參配伍通過(guò)調(diào)節(jié)瞬時(shí)受體電位通道1 介導(dǎo)的CaMK 抑制缺血性心肌重構(gòu)[12]。基于CaMKⅡδ與RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)間的可能關(guān)系，本研究進(jìn)一步觀察黃芪-丹參配伍對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2壞死性凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞H9C2，購(gòu)于武漢Procell公司，貨號(hào)CL-0089。

1.2 藥物及制備

黃芪、丹參飲片購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房。根據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》最大推薦用量（黃芪30 g、丹參15 g）[16]，取黃芪6 kg、丹參3 kg，加水，回流提取1.5 h×2 次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮為稠膏，以95%乙醇調(diào)節(jié)含醇量為70%，靜置沉淀后取上清液，105 ℃減壓干燥48 h，制成黃芪丹參干粉，1 g干粉相當(dāng)于5 g飲片。采用高效液相色譜法檢測(cè)黃芪丹參干粉質(zhì)控成分黃芪甲苷和丹參素含量[17]。

取適量黃芪丹參干粉，加入PBS，80 ℃恒溫水浴鍋加熱使其充分溶解，12 000 r/min離心5 min×2次，上清液以0.45 μm濾膜過(guò)濾，超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.22 μm濾膜過(guò)濾藥液除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取0.1、0.5、1 mL配制好的干粉溶液，置于1.5 mL離心管中（提前稱定質(zhì)量），60 ℃烘箱中放置48 h蒸干水分，再次稱量離心管質(zhì)量，計(jì)算2次質(zhì)量差值，即為藥物質(zhì)量，根據(jù)對(duì)應(yīng)體積計(jì)算藥物濃度，取平均值作為實(shí)際藥物濃度。

1.3 主要試劑與儀器

CaMKⅡδ、受體相互作用蛋白激酶（RIPK）1、RIPK3、混合系激酶區(qū)域樣蛋白（MLKL）、GAPDH抗體（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)分別為ab181052、ab300617、ab255705、ab9485），心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢Procell公司，貨號(hào)CM-0089），胎牛血清（美國(guó)Gibco，貨號(hào)C0235），CaMKⅡδ 激活劑油酸（德國(guó)Sigma，貨號(hào)O1008），CaMKⅡδ抑制劑KN-93磷酸鹽（美國(guó)Selleck，貨號(hào)S7423），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Sigma公司，貨號(hào)APOAF），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒（日本Takara公司，貨號(hào)分別為RR036A、RR820A），PVDF 膜（美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)ISEQ00010），CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒、Trizol、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液（上海碧云天公司，貨號(hào)分別為C0037、C0016、R0016、P0012S、P0018FS）。

超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO公司，型號(hào)ACB-6E1），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)310370），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，型號(hào)Varioskan LUX），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司，型號(hào)CytoFLEX），RTPCR 循環(huán)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)CFX Opus Deepwell），電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)PowerPac），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)ChemiDocTMTouch）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及造模

H9C2細(xì)胞用心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)基替換為無(wú)血清培養(yǎng)基，于37 ℃、95%N2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h。隨后替換成含10%胎牛血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2、95%空氣培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)12 h制備缺氧/復(fù)氧模型。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度接種至96孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和黃芪丹參組，黃芪丹參組分別加入20、40、60、80 μg/mL干粉溶液處理2 h，按“1.4”項(xiàng)下方法缺氧/復(fù)氧造模處理，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入CCK-8 工作液100 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度）÷（對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.6 分組及干預(yù)

將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、黃芪丹參組、黃芪丹參+激活劑組和抑制劑組。對(duì)照組正常培養(yǎng)，其余各組按“1.4”項(xiàng)下方法制備缺氧/復(fù)氧模型。黃芪丹參組造模前2 h用60 μg/mL干粉溶液預(yù)處理細(xì)胞，黃芪丹參+激活劑組造模前2 h用100 μmol/L油酸和60 μg/mL干粉溶液預(yù)處理細(xì)胞，抑制劑組造模前2 h用10 μmol/L KN-93磷酸鹽預(yù)處理細(xì)胞。

1.7 乳酸脫氫酶水平檢測(cè)

細(xì)胞按“1.6”項(xiàng)下分組處理后，收集培養(yǎng)液，1 000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm測(cè)量吸光度，計(jì)算LDH釋放率。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞按“1.6”項(xiàng)下分組處理，預(yù)冷PBS清洗3次，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用PBS重懸，用碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)

用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 Western blot檢測(cè)

加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后，取等量蛋白（30 μg）上樣，10%SDS-PAGE（100 V、120 min）分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入CaMKⅡδ、RIPK、RIPK3、MLKL 一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入二抗（1∶20 000），室溫孵育 1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。使用ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較用方差分析，Tukey法進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-丹參濃度篩選

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，造模處理后，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組對(duì)細(xì)胞存活率有促進(jìn)作用（見圖1），尤其是濃度60、80 μg/mL（P＜0.01），且60 μg/mL作用優(yōu)于80 μg/mL（P＜0.05），因此選用60 μg/mL作為細(xì)胞干預(yù)濃度。

圖1 各組H9C2細(xì)胞存活率比較（±s，n=6）

2.2 黃芪-丹參對(duì)H9C2 細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液LDH釋放率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組和抑制劑組細(xì)胞上清液LDH釋放率明顯降低（P＜0.01）；與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細(xì)胞上清液LDH釋放率明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組H9C2細(xì)胞上清液 LDH釋放比較（±s，n=6）

2.3 黃芪-丹參對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參+激活劑組、黃芪丹參組和抑制劑組細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P＜0.01）。與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細(xì)胞凋亡水平明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組H9C2細(xì)胞凋亡比較（±s，n=6）

2.4 黃芪-丹參對(duì)H9C2 細(xì)胞CaMK Ⅱδ-RIPK1/RIPK3-MLKL信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組和抑制劑組細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3 和MLKL mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組H9C2細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組H9C2細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪丹參組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組模型組黃芪丹參+激活劑組黃芪丹參組抑制劑組MLKL 1.09±0.12 2.96±0.56**2.52±0.29△1.62±0.26#2.07±0.86#n 3 3 3 3 3 CaMKⅡδ 1.08±0.11 3.12±0.29**3.21±0.46△1.49±0.86#1.27±0.42#RIPK1 1.06±0.25 3.84±0.41**3.64±0.58△2.22±0.63#2.02±0.11#RIPK3 1.07±0.21 3.29±0.25**2.92±0.46△1.58±0.58#1.68±0.46#

2.5 黃芪-丹參對(duì)H9C2 細(xì)胞CaMK Ⅱδ-RIPK1/RIPK3-MLKL信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪丹參組和抑制劑組細(xì)胞CaMK Ⅱδ、RIPK1、RIPK3 和MLKL 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與黃芪丹參組比較，黃芪丹參+激活劑組細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK3 和MLKL 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表3。

圖4 各組H9C2細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白免疫印跡

表3 各組H9C2細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組H9C2細(xì)胞CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與黃芪丹參組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對(duì)照組模型組黃芪丹參+激活劑組黃芪丹參組抑制劑組MLKL 0.12±0.03 0.73±0.11**0.61±0.18△0.26±0.08##0.22±0.02##n 3 3 3 3 3 CaMKⅡδ 0.19±0.05 2.89±0.32**1.92±0.21#△△0.28±0.08##0.16±0.06##RIPK1 0.31±0.08 2.31±0.19**1.23±0.21##0.86±0.17##0.52±0.11##△RIPK3 0.82±0.19 2.12±0.21**1.96±0.23△0.92±0.34##0.98±0.27##

3 討論

本研究結(jié)果顯示，黃芪-丹參預(yù)處理在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用，表現(xiàn)為提高細(xì)胞存活率，降低LDH釋放和壞死性凋亡。

壞死性凋亡是壞死細(xì)胞死亡的程序化形式，心肌細(xì)胞的壞死性凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要標(biāo)志[18]。壞死性凋亡受壞死性凋亡調(diào)節(jié)蛋白（如RIPK1、RIPK3和MLKL）調(diào)控，RIP1位于細(xì)胞質(zhì)中，廣泛分布于心肌組織，是壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。死亡受體的激活進(jìn)一步激活RIPK1，RIPK1 轉(zhuǎn)移并結(jié)合RIPK3和MLKL，形成復(fù)合物，RIP3-MLKL復(fù)合物會(huì)誘導(dǎo)壞死性凋亡[19]。本研究中，缺氧/復(fù)氧損傷能上調(diào)細(xì)胞RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)，黃芪-丹參預(yù)處理能顯著下調(diào)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)，提示黃芪-丹參通過(guò)RIPK1-RIPK3-MLKL途徑減輕心肌細(xì)胞壞死性凋亡。

持續(xù)的CaMKⅡ激活在多種心臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。CaMKⅡ激活誘發(fā)程序性細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡，加速心力衰竭[20]。CaMKⅡ整合β-腎上腺素能、Gq偶聯(lián)受體、活性氧、高血糖和促凋亡細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)內(nèi)在和外在途徑誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[8]。此外，壞死性凋亡調(diào)節(jié)蛋白活性也與CaMKⅡ相關(guān)[21]。為闡明CaMKⅡδ與壞死性凋亡通路RIPK1/RIPK3-MLKL 的關(guān)系，本研究進(jìn)一步檢測(cè)CaMKⅡ抑制劑KN-93磷酸鹽和激動(dòng)劑油酸干預(yù)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞RIPK1、RIPK3、MLKL表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，CaMKⅡ抑制劑預(yù)處理顯著下調(diào)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)，結(jié)合抑制劑組細(xì)胞凋亡率和上清液LDH水平降低，提示CaMKⅡ抑制劑通過(guò)RIPK1/RIPK3-MLKL途徑減輕心肌細(xì)胞壞死性凋亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ激動(dòng)劑可以逆轉(zhuǎn)黃芪-丹參抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)控效應(yīng)，提示黃芪-丹參對(duì)RIPK1/RIPK3-MLKL途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死性凋亡的調(diào)控作用與調(diào)控CaMKⅡ有關(guān)。結(jié)合前期研究[12]，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，黃芪-丹參可下調(diào)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的CaMKⅡδ表達(dá)。

綜上，黃芪-丹參配伍對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與下調(diào)CaMKⅡδ表達(dá)，抑制RIPK1/RIPK3-MLKL通路激活，從而緩解細(xì)胞凋亡性壞死有關(guān)。