顏思陽 ，楊仁義 ，陳瑤 ，劉利娟 ，高曉峰 ，周德生

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因，是中國第一大死亡因素[1-3]。目前治療缺血性腦卒中主要在早期疏通血管，恢復(fù)灌注，但可能造成不可逆的神經(jīng)功能損傷，即腦缺血再灌注損傷（CIRI）。線粒體自噬可選擇性識別和清除功能紊亂的線粒體。在這一過程中，線粒體被PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PINK1）、Parkin、Bcl-2、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）等相關(guān)因子識別，進行選擇性自噬[4]。通過自噬進行線粒體質(zhì)量控制成為干預(yù)CIRI可能的靶點，但線粒體自噬在CIRI中的作用一直存在爭議，受損線粒體清除不足或必要線粒體降解過度都將導(dǎo)致細胞死亡[5]。

課題組前期從榮氣虛滯角度探討了榮氣部分功能與線粒體功能的相關(guān)性[6]，并對基于榮氣虛滯理論立方的活血榮絡(luò)方進行了體內(nèi)實驗研究，結(jié)果表明，其可通過激活PINK1/Parkin信號通路上調(diào)線粒體自噬，減輕大鼠神經(jīng)功能損害[7]。本研究建立氧糖剝奪/復(fù)氧糖（OGD/R）損傷的PC12細胞模型，以PINK1/Parkin通路為切入點，從線粒體自噬角度探討活血榮絡(luò)方改善CIRI神經(jīng)元損傷的機制。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

12～15 周齡SPF 級SD 雄性大鼠20 只，體質(zhì)量250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，使用許可證號SYXK（湘）2015-0003，依照實驗動物中心管理辦法，飼養(yǎng)溫度21～26 ℃，濕度40%～50%，通風(fēng)良好，自然晝夜交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20201010-13）。PC12細胞株（貨號TCR9），購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 藥物及制備

活血榮絡(luò)方（雞血藤30 g，石楠藤30 g，生地黃15 g，玄參10 g，黃精15 g，乳香10 g，沒藥10 g，川芎10 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張裕民主任藥師鑒定?；钛獦s絡(luò)方浸膏參照課題組前期研究方法制備[8]。雷帕霉素（貨號S1039，美國Selleck公司）。

1.3 主要試劑及儀器

胎牛血清（貨號10270-106）、100×青霉素-鏈霉素混合液（貨號15140122），美國Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號SH30022.01），美國Hyclone 公司；DMEM無糖培養(yǎng)基（貨號PM150270），武漢Procell公司；JC-1 線粒體膜電位（MMP）檢測試劑盒（貨號C2006）、Mito-Tracker Red CMXRos（貨號C1035-50），上海碧云天生物；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號70-PQ0012），杭州聯(lián)科生物；微管蛋白1 輕鏈3B 一抗（LC3B，貨號ab48394）、p62 一抗（貨號ab91526）、線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20 一抗（TOMM20，貨號ab186735）、PINK1一抗（貨號ab23707）、Parkin一抗（貨號ab77924）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號ab6721）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（貨號ab6789），英國Abcam 公司；β-actin 抗體（貨號20536-1-AP）、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號SA00003-2），武漢三鷹生物；Alexa Fluor 647 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（貨號A0473），上海碧云天生物。3427普通培養(yǎng)箱、3131三氣培養(yǎng)箱、900Series超低溫冰箱、Fresco17低溫高速離心機，美國Thermo Scientific公司；SYG-1210恒溫水浴鍋，美國Crystal儀器公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Delta Vision高分辨活細胞成像系統(tǒng)，英國Cytiva公司；Milli-Q IQ-7000超純水儀，美國Meck Millipore；1658001小型垂直電泳槽、1703930小型轉(zhuǎn)印槽、1645050基礎(chǔ)電泳儀，美國Bio-Rad公司；Chemi DocTMXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀，美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

20只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組和給藥組，給藥組予活血榮絡(luò)方浸膏稀釋液（濃度2.34 g/mL）23.4 g/kg灌胃，正常對照組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后以10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠，暴露腹主動脈，使用負壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，即為活血榮絡(luò)方含藥血清和空白血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理

復(fù)蘇PC12細胞，用含5%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d更換培養(yǎng)基1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為正常對照組、模型組、空白血清組（KBXQ 組）、活血榮絡(luò)方含藥血清組（H-HYXQ組）和雷帕霉素組（RAP組）。正常對照組常規(guī)培養(yǎng)，其余各組細胞貼壁24 h后，將培養(yǎng)基更換為DMEM無糖培養(yǎng)基，并將細胞轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2、95%N2、1%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，隨后更換為相應(yīng)培養(yǎng)基于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，建立OGD/R損傷細胞模型[9]。其中模型組更換為完全培養(yǎng)基，KBXQ組為10%空白血清完全培養(yǎng)基，H-HYXQ組為10%活血榮絡(luò)方含藥血清完全培養(yǎng)基[10-11]，RAP組為含200 nmol/L雷帕霉素的完全培養(yǎng)基[9]。

2.3 JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位

細胞按以上方法處理后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞1次，每孔分別加入完全培養(yǎng)基1 mL和JC-1染色液1 mL，充分混勻，置于常規(guī)養(yǎng)箱孵育20 min，吸去上清液，JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入完全培養(yǎng)基2 mL，熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)MMP較高時，JC-1在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，呈紅色熒光；當(dāng)MMP下降時，JC-1轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w，呈綠色熒光。以紅色熒光/綠色熒光比值表示MMP。

2.4 免疫熒光染色分析線粒體-LC3B共定位

OGD/R誘導(dǎo)及藥物處理同“2.2”項下，預(yù)定時間點前15～30 min，去除細胞培養(yǎng)基，加入Mito-Tracker Red CMXRos工作液染線粒體，常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)至24 h，去除Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37 ℃溫育的完全培養(yǎng)基洗滌細胞，進行固定、破膜、封閉、一抗孵育（LC3B 1∶100）、二抗孵育（FITC 1∶100）、染核、封片等步驟，使用Delta Vision高分辨活細胞成像系統(tǒng)拍照，使用Image J軟件Colocalization Finder插件對各組細胞線粒體-LC3B 共定位進行分析，通過ScatterPlot散點圖、Pearson相關(guān)系數(shù)（Rr）、Maders重疊系數(shù)（R）對線粒體-LC3B共定位關(guān)系進行描述[12]，定量數(shù)據(jù)解釋見表1[13]。

2.5 免疫熒光染色分析線粒體-PINK1-Parkin共定位

OGD/R 誘導(dǎo)及藥物處理同“2.2”項下，加入Mito-Tracker Red CMXRos 工作液染線粒體，進行固定、破膜、封閉、一抗孵育（PINK1 1∶100、Parkin 1∶200）、二抗孵育（FITC 1∶100）、染核、封片等操作，使用Delta Vision高分辨活細胞成像系統(tǒng)拍照，分別對線粒體-PINK1、線粒體-Parkin、PINK1-Parkin進行共定位分析，共定位分析方法及描述同“2.4”項下，進一步繪制Rr、R相關(guān)系數(shù)圖，以顏色深淺表示相關(guān)性強弱（顏色越深表示相關(guān)性越強）。

2.6 Western blot檢測

OGD/R誘導(dǎo)及藥物處理同“2.2”項下，裂解并提取蛋白，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，配制成2 μg/μL蛋白溶液，金屬浴100 ℃加熱10 min使蛋白變性。SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加LC3B 一 抗（1∶1 000）、p62 一 抗（1∶2 000）、TOMM20一抗（1∶2 000）、PINK1一抗（1∶1 000）、Parkin 一抗（1∶1 000）、β-actin 一抗（1∶4 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后加對應(yīng)二抗（山羊抗兔IgG 1∶8 000、山羊抗小鼠IgG 1∶8 000）孵育，TBST洗滌后化學(xué)發(fā)光法顯影。使用Image J軟件檢測圖像灰度值并進行分析，以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 含藥血清對PC12細胞線粒體膜電位的影響

與正常對照組比較，模型組PC12細胞MMP明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，KBXQ組、H-HYXQ組和RAP組PC12細胞MMP明顯升高（P＜0.01）；與KBXQ組比較，H-HYXQ組PC12細胞MMP明顯升高（P＜0.05）；與H-HYXQ 組比較，RAP 組PC12 細胞MMP明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組PC12細胞MMP比較（±s，%）

表2 各組PC12細胞MMP比較（±s，%）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與KBXQ組比較，▲P＜0.05；與H-HYXQ組比較，□P＜0.05

MMP 1.80±0.15 0.86±0.01**1.24±0.11##1.39±0.04##▲1.62±0.12##□組別正常對照組模型組KBXQ組H-HYXQ組RAP組n 3 3 3 3 3

4.2 含藥血清對PC12細胞線粒體-LC3B共定位的影響

熒光顯微鏡下可見紅色熒光標(biāo)記的線粒體（Mito）和綠色熒光標(biāo)記的LC3B，結(jié)合Rr、R結(jié)果分析表明，正常對照組、模型組和KBXQ組PC12細胞Mito-LC3B共定位關(guān)系Rr 為強，R 為弱或中等；H-HYXQ 組和RAP組PC12細胞Mito-LC3B共定位關(guān)系Rr為非常強，R為強或中等，提示H-HYXQ、RAP能增強Mito-LC3B共定位，激活線粒體自噬。見圖1、表3。

圖1 各組PC12細胞Mito-LC3B共定位分析（免疫熒光染色，×600）

表3 各組PC12細胞Mito-LC3B共定位Rr、R比較

4.3 含藥血清對PC12 細胞線粒體-PINK1-Parkin 共定位的影響

PINK1/Parkin通路介導(dǎo)線粒體自噬，需要線粒體亞定位，故在標(biāo)記Mito的基礎(chǔ)上進行PINK1、Parkin蛋白熒光染色。各組細胞Mito、PINK1、Parkin熒光染色及共定位分析見圖2，Mito、PINK1、Parkin的相關(guān)性分析見圖3。

圖2 各組PC12細胞Mito-PINK1-Parkin共定位分析（免疫熒光染色，×600）

圖3 各組PC12細胞Mito、PINK1、Parkin相關(guān)性分析

各組細胞Mito-PINK1 Rr、R 均顯示存在共定位（0.62≤Rr≤0.89，0.64≤R≤0.7）。正常對照組細胞Mito-Parkin無共定位（Rr＜0.5，R＜0.6），模型組細胞Mito-Parkin 存在共定位，但相關(guān)性較低（Rr=0.77，R=0.79）；與模型組比較，KBXQ組細胞Mito-Parkin共定位降低（Rr=0.61，R=0.69），H-HYXQ組和RAP組細胞Mito-Parkin共定位增強。正常對照組細胞PINK1-Parkin蛋白無明顯共定位（Rr=0.2，R=0.36），模型組細胞PINK1-Parkin 共定位增強（Rr=0.53，R=0.52），H-HYXQ組和RAP組細胞共定位進一步增強（Rr≥0.7，R≥0.82）。

4.4 含藥血清對PC12 細胞自噬相關(guān)蛋白及PINK1/Parkin通路蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞LC3B蛋白表達升高，p62、TOMM20蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，H-HYXQ組和RAP組細胞LC3B蛋白表達升高（P＜0.01），p62、TOMM20蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與KBXQ組比較，H-HYXQ組和RAP組細胞LC3B蛋白表達明顯升高（P＜0.05），p62、TOMM20蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 各組PC12細胞LC3B、p62、TOMM20蛋白免疫印跡

圖5 各組PC12細胞p62、LC3B、TOMM20蛋白表達比較（±s，n=3）

與正常對照組比較，模型組細胞PINK1、Parkin蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，H-HYXQ組和RAP組細胞PINK1、Parkin蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與KBXQ組比較，H-HYXQ組和RAP組細胞PINK1、Parkin蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖6、圖7。

圖6 各組PC12細胞PINK1、Parkin蛋白免疫印跡

圖7 各組PC12細胞PINK1、Parkin蛋白表達比較（±s，n=3）

5 討論

腦缺血再灌注是極為復(fù)雜的病理生理過程，呈快速級聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過氧化、氧自由基損傷、細胞毒性作用、炎癥因子損害等[14-16]。研究表明，腦缺血再灌注中線粒體損傷及功能紊亂是造成神經(jīng)細胞死亡的重要原因[17]。線粒體自噬作為一種清除受損線粒體的途徑，在腦缺血再灌注中起重要作用，但目前尚有爭議[17]。自噬可以在缺血期起保護作用，一旦發(fā)生缺血/再灌注就會產(chǎn)生不同的作用[18-19]。腦卒中后重度高血糖可通過抑制線粒體自噬激活，阻礙急性缺血早期內(nèi)源性受損線粒體的清除，導(dǎo)致受損線粒體堆積，進而擴大線粒體介導(dǎo)的下游凋亡損傷，加重大鼠腦梗死損傷程度[20]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后BNIP3表達升高造成線粒體自噬過度激活，引起遲發(fā)性細胞死亡，加重CIRI[21]。雖然線粒體自噬在CIRI中所起的作用一直存在爭議，但能夠確定，受損線粒體的過度清除和清除不足均導(dǎo)致細胞死亡[22]。

PINK1/Parkin 通路調(diào)控的線粒體自噬最為典型。其中，PINK1在腦內(nèi)高表達，能作為受損線粒體的分子感受器，Parkin主要介導(dǎo)底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。PINK1和Parkin廣泛表達于組織器官，尤以腦、心肌、骨骼肌等高耗能器官含量豐富，可作為線粒體受損時的第一道防線。有研究表明，PINK1和Parkin參與CIRI病理過程，PINK1以穩(wěn)定的形式存在于正常細胞的線粒體外膜上，當(dāng)MMP 下降時，PARK2/Parkin被招募至線粒體并被PINK1磷酸化[23]，線粒體外膜蛋白在Parkin的作用下被泛素化，受體蛋白p62 識別并標(biāo)記到被泛素化的線粒體外膜蛋白上，LC3B通過識別p62蛋白，結(jié)合定位于去極化的線粒體上，進一步誘導(dǎo)功能失調(diào)的線粒體通過自噬降解[24-25]。體內(nèi)實驗表明，腦缺血再灌注后出現(xiàn)LC3B、Beclin1和LAMP-1表達上調(diào)及線粒體自噬激活，并在24 h后達到峰值，且再灌注24 h后線粒體外膜PINK1積累顯著增加，Parkin/p62 線粒體易位增加，表明PINK1/Parkin/p62信號通路參與缺血和再灌注后的病理生理過程[26]。課題組前期研究表明，基于榮氣虛滯理論立方的活血榮絡(luò)方能通過調(diào)控PINK/Parkin信號通路，減輕CIRI模型大鼠神經(jīng)功能缺損[7]。本研究以雷帕霉素為陽性對照，檢測MMP，結(jié)果表明OGD/R誘導(dǎo)的PC12損傷可使MMP下降，而活血榮絡(luò)方含藥血清及雷帕霉素可上調(diào)MMP以減輕細胞損傷。同時通過免疫熒光染色、Western blot檢測表明，活血榮絡(luò)方含藥血清可促進Mito-LC3B 共定位，上調(diào)LC3B，下調(diào)p62、TOMM20蛋白表達，同時增強Mito-PINK1-Parkin共定位，激活PINK1/Parkin通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)OGD/R損傷相關(guān)的線粒體自噬的作用。

綜上，活血榮絡(luò)方可能通過調(diào)控PINK1/Parkin通路增加Parkin蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位，上調(diào)LC3B，下調(diào)p62、TOMM20 蛋白表達，激活線粒體自噬，減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞損傷。本研究可為闡明活血榮絡(luò)方干預(yù)CIRI的機制提供實驗依據(jù)。