許瑞 ，張艷 ，何佳 ，尹文浩 ，鄒文聰 ，劉嫻賢 ，何曉騰

1.遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110847；

2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；

3.遼寧中醫(yī)藥大學博士后流動站，遼寧 沈陽 110847

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段。根據(jù)《2020中國心力衰竭醫(yī)療質量控制報告》，我國35歲以上居民心力衰竭患病率為1.3%，與2000年相比患病人數(shù)增加近500萬，嚴重影響我國居民健康[1]。急性心肌梗死常合并心力衰竭，主要表現(xiàn)為急性心肌細胞壞死后心臟結構和/或功能異常導致心輸出量降低及肺循環(huán)或體循環(huán)瘀血等一系列臨床綜合征[2]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞膜表面水通道蛋白（AQP）4的異常表達與心力衰竭時水液代謝紊亂密切相關，影響心臟組織水腫及心肌梗死后心功能不全或慢性心力衰竭的進展[3-4]。心力衰竭時會發(fā)生嚴重的腸道細菌移位和水液代謝紊亂、液體超載[5-6]，而結腸組織表面AQP4異常表達會導致結腸對水分的吸收和分泌紊亂[7]。由此推測，心力衰竭后結腸水液代謝失調與AQP4維持水的轉運功能障礙密切相關。課題組前期研究表明，AQP2參與腎臟水液代謝，應用補腎活血方可明顯下調心力衰竭大鼠AQP2表達、緩解利尿劑抵抗、減少水腫，起到治療心力衰竭作用[8]。補腎活血復方由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院張艷教授團隊結合多年臨床經(jīng)驗在該院院內制劑參草通脈顆?；A上化裁而成。研究顯示，參草通脈顆粒可提高慢性心力衰竭患者生活質量[9]，解決部分患者利尿劑抵抗的問題，緩解尿少、大便異常癥狀，改善心功能，延緩心力衰竭進展[10]。本研究基于“腎藏精主水”理論，聚焦心、腸之間水液代謝關系，探析補腎活血復方治療心肌梗死后心力衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠60只，13周齡，體質量（230±10）g，遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（遼）2015-0001。于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，通風良好，每日光照12 h，溫度25 ℃、濕度50%，自由攝食飲水。普通飼料由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。本實驗經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學倫理委員會審批（21000092019038）。

1.2 藥物

補腎活血復方由菟絲子20 g、龜甲膠15 g、黃精20 g、黃芪40 g、丹參30 g、人參10 g、紅花15 g、益母草20 g、三七5 g組成，飲片由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑中心提供，由本課題組制成原藥材濃度為1.575 g/mL煎液。托伐普坦片，15 mg/片，浙江大冢制藥有限公司，批號211107S，用蒸餾水配制成濃度為0.135 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

N 端腦鈉肽前體（NT-proBNP）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司，貨號ml003242-C），AQP4抗體（英國Abcam公司，貨號ab259318），β-actin抗體（美國Affinity Biosciences公司，貨號AF7018），蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0013B），蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司，貨號P1050），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0010），ECL顯色液（上海天能科技有限公司，貨號180-501），HRP-羊抗兔IgG（艾美捷科技有限公司，貨號A12004-1），10%PAGE凝膠制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥技術有限公司，貨號03648300）。小動物心電圖機（湖南鼠行生物科技有限公司，型號RM6240B/RM6280C/RM-62160C），小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司，型號HX-300），彩色多普勒超聲診斷儀（美國通用電氣公司，型號Vivid 7 Dimension），多功能酶標儀（美國Thermo公司，型號Multiskan MK3），組織包埋機、石蠟切片機（德國Leica公司，型號ASP6025/RM2235），顯微攝像系統(tǒng)（日本OLYMPUS 公司，型號DP73），電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號JY300C）。

1.4 造模、分組及給藥

60只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，用隨機數(shù)字表法分為空白組15只和實驗組45只?？瞻捉M不予處理。實驗組禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，固定于手術臺，氣管插管，連接小動物呼吸機，設置呼吸頻率80～100次/min、呼吸比2∶1、潮氣量6～8 mL，接通心電圖。待大鼠呼吸平穩(wěn)后，于胸骨左緣第3～4肋間備皮，暴露皮膚，碘伏消毒，手術刀切開后鈍性分離胸部肌肉，鑷子分離胸膜，擴胸器撐開胸腔，充分暴露心臟，擠壓右側胸腔并托舉心臟，鈍性分離心包膜，于左冠狀動脈前降支距分叉3～4 mm處用縫合線結扎。閉合胸腔，手術線逐層縫合各層組織，術后心電圖顯示肢體導聯(lián)ST段抬高≥0.1 mV（見圖1），提示急性心肌梗死造模成功[11]。待大鼠呼吸恢復正常，撤去呼吸機和氣管導管，連續(xù)5 d腹腔注射青霉素6萬單位避免傷口感染。存活大鼠正常飲食1周后飼料減半，且每日力竭式游泳1次（持續(xù)游泳至肢體無明顯擺動及頭部完全沒入水中3 s以上），持續(xù)28 d。大鼠行心臟彩超檢測左心室射血分數(shù)（EF）≤50%表明心力衰竭造模成功[11]。將最終造模成功的28只大鼠隨機分為模型組10只、托伐普坦組9只和補腎活血組9只。按人與大鼠等效劑量換算，托伐普坦組灌胃托伐普坦溶液1.35 mg/kg，補腎活血組灌胃補腎活血復方煎液15.75 g/kg[8，12]，3 mL/次，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)4周。

圖1 大鼠造模前后心電圖

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠體征觀察實驗過程中觀察大鼠毛色、精神、活動、飲食、二便、體質量以及有無喘促癥狀等。

1.5.2 左心室結構與功能檢測

干預結束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定于操作臺，心前區(qū)脫毛膏脫毛備皮，探頭涂抹耦合劑貼于大鼠心前區(qū)，應用心臟彩超檢測左心室結構[收縮末內徑（ESD）、舒張末內徑（EDD）]與功能[EF、短軸縮短率（FS）]。

1.5.3 血清N端腦鈉肽前體含量測定

腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心5 min，分離血清，ELISA測定血清NT-proBNP含量，嚴格按試劑盒說明書操作，酶標儀波長450 nm 處測定各孔OD 值，計算NT-proBNP含量。

1.5.4 心肌和結腸組織形態(tài)觀察

干預結束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，沿正中線打開腹腔，刺破橫隔膜，取出心臟和結腸，用生理鹽水沖洗，剪取左心室心肌組織與結腸組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，每組隨機選取4張切片進行HE染色，光鏡下觀察心肌和結腸組織形態(tài)。

1.5.5 心肌和結腸組織蛋白檢測

將心肌和結腸組織用超聲破碎機勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，分離上清液，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，電泳槽加Marker及心肌和結腸組織蛋白樣品，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳1.5 h。PVDF膜浸入甲醇活化5～10 min，將蛋白轉印至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST洗膜5 min，重復2次，內參蛋白（β-actin）及目的蛋白（AQP4）一抗以1∶1 000稀釋，PVDF膜置于孵育盒中，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜10 min，重復3次，二抗以1∶10 000稀釋，將膜放入孵育盒中，室溫孵育2 h。TBST洗膜10 min，重復3次，顯色劑曝光成像，用Image J 1.8.0分析條帶灰度值，計算AQP4相對表達量（AQP4灰度值/β-actin灰度值）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行分析，GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖。計量資料符合正態(tài)分布用±s表示，多組間比較方差齊采用方差分析，方差不齊采用秩和檢驗，兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 補腎活血復方對模型大鼠體征的影響

給藥過程中，因灌胃不當、嚴重并發(fā)癥等原因大鼠共死亡6只，最終空白組11只、模型組8只、托伐普坦組和補腎活血組各9只。

空白組大鼠毛色光澤，精神佳，反應靈敏，活潑好動，飲食、二便正常，體質量逐漸增加；模型組大鼠毛色黯淡、脫毛嚴重，爪、尾部呈紫色，精神頹廢，身體慵懶，活動量小，納差，尿少，大便秘結，體質量減輕，部分有呼吸急促、喘促及哮鳴音表現(xiàn)；托伐普坦組和補腎活血組大鼠毛色光澤逐漸恢復，精神良好，活動、飲食、二便及體質量均有改善，無喘促等癥狀。

2.2 補腎活血復方對模型大鼠左心室結構與功能的影響

與空白組比較，模型組大鼠左心室ESD、EDD明顯增加，EF和FS明顯減小（P＜0.05）；與模型組比較，托伐普坦組與補腎活血組大鼠左心室ESD、EDD明顯減小，EF、FS明顯增加（P＜0.05）；與托伐普坦組比較，補腎活血組大鼠左心室ESD、EDD、EF、FS差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1 各組大鼠左心室結構與功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠左心室結構與功能指標比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別空白組模型組托伐普坦組補腎活血組FS/%41.46± 8.29 22.85±14.57#35.61± 5.93*34.61± 4.15*只數(shù)11 8 9 9 ESD/mm 3.35±0.36 5.50±0.82#4.03±0.42*4.12±0.34*EDD/mm 5.77±0.47 7.18±0.52#6.27±0.49*6.31±0.49*EF/%66.91±4.84 35.41±5.61#54.48±5.41*57.03±4.23*

圖2 各組大鼠心臟彩超

2.3 補腎活血復方對模型大鼠血清N 端腦鈉肽前體含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清NT-proBNP含量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，托伐普坦組和補腎活血組大鼠血清NT-proBNP 含量明顯減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清NT-proBNP含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清NT-proBNP含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

NT-proBNP 19.03±9.96 34.78±5.22#22.64±5.21*25.05±6.35*組別空白組模型組托伐普坦組補腎活血組只數(shù)11 8 9 9

2.4 補腎活血復方對模型大鼠心肌和結腸組織形態(tài)的影響

空白組大鼠心肌結構形態(tài)完整，心肌纖維排列有序，細胞核無固縮、溶解，肌原纖維無斷裂、損傷；模型組大鼠梗死區(qū)心肌細胞壞死，周圍存活心肌出現(xiàn)心肌細胞代償性肥大、心肌間質成分增加、心肌纖維化甚至瘢痕組織形成；托伐普坦組和補腎活血組大鼠心肌纖維排列較整齊，部分心肌纖維斷裂、壞死，細胞核位于細胞邊緣，極少細胞核固縮、碎裂，較模型組顯著改善。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌和結腸組織形態(tài)（HE染色，×200）

空白組大鼠結腸黏膜完整，上皮排列有序，杯狀細胞豐富，無淋巴細胞浸潤；模型組大鼠結腸黏膜上皮排列紊亂，杯狀細胞較少，大量淋巴細胞浸潤；托伐普坦組和補腎活血組大鼠結腸黏膜上皮相對完整、排列較整齊，杯狀細胞較多，偶見少量淋巴細胞浸潤，較模型組顯著改善。見圖3。

2.5 補腎活血復方對模型大鼠心肌和結腸組織水通道蛋白4表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織AQP4蛋白表達明顯升高（P＜0.05），結腸組織AQP4蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，托伐普坦組和補腎活血組大鼠心肌組織AQP4 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），結腸組織AQP4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與托伐普坦組比較，補腎活血組大鼠心肌和結腸組織AQP4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖4、表3。

表3 各組大鼠心肌和結腸組織AQP4蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠心肌和結腸組織AQP4蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與托伐普坦組比較，△P＜0.05

結腸組織1.54±0.41 0.19±0.07#0.40±0.04*1.01±0.19*△組別空白組模型組托伐普坦組補腎活血組只數(shù)11 8 9 9心肌組織0.28±0.15 1.29±0.11#0.10±0.06*0.80±0.08*△

圖4 各組大鼠心肌和結腸組織AQP4蛋白免疫印跡

3 討論

慢性心力衰竭病情較重且病程長，其相應的實驗模型難度較大。雖然心肌缺血性心力衰竭造模操作較為復雜，死亡率略高，但成模時間短，且模擬了心肌梗死后心功能下降、心室重構，最終發(fā)展為心力衰竭的過程。冠狀動脈結扎法是急性心肌缺血模型的常用方法[13]。因此，本實驗慢性心力衰竭造模采用心肌缺血性心力衰竭，通過結扎大鼠左冠狀動脈造成心肌梗死，再配合力竭式游泳、饑餓造成慢性心力衰竭[14]，此法更貼近臨床。

心肌梗死后心力衰竭動物模型制備可通過心電圖檢測、心臟結構與心功能檢測、NT-proBNP檢測及心肌病理形態(tài)觀察等判斷模型是否成功。本研究對比大鼠左冠狀動脈前降支結扎前后心電圖，結扎后ST段抬高，提示結扎成功，引起急性心肌梗死。超聲心動圖可無創(chuàng)檢測心臟結構和心功能，本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠左心室增大，心功能明顯下降，左心室EF 為35.41%，明顯低于空白組，符合心力衰竭判定標準。NT-proBNP主要由心室肌細胞合成與分泌，反映心室容量負荷與壓力變化。心肌梗死后心力衰竭時左心室增大，心室肌細胞合成并分泌大量NT-proBNP入血，因此其含量變化與心力衰竭診斷及指導用藥密切相關[15]，也可用于評估心力衰竭預后[16]。本實驗模型組大鼠血清NT-proBNP含量明顯高于空白組，說明心肌梗死后心室肌發(fā)生一系列形態(tài)結構重構。HE染色顯示模型組大鼠梗死區(qū)心肌細胞壞死，周圍存活心肌出現(xiàn)心肌細胞代償性肥大、心肌間質成分增加、心肌纖維化甚至瘢痕組織形成等變化，使心室發(fā)生不可逆重構，進而發(fā)展為心力衰竭。

中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭效果顯著，但中藥方-證的辯證關系及其作用機制尚不明確。因此，采用動物模型論證中醫(yī)藥理論是促進中醫(yī)藥發(fā)展和實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的有效舉措[17-18]。中醫(yī)學認為，慢性心力衰竭基本病機以心腎陽氣虧虛為本，血瘀、痰飲、水毒為標。本研究參考氣虛血瘀型動物模型[19]和心力衰竭動物模型[11，14]的制備，結合氣虛血瘀型心力衰竭乏力、喘促發(fā)病特點，建立大鼠氣虛血瘀型心力衰竭動物模型，結果顯示，模型組大鼠爪、尾部呈紫色，精神頹廢，身體慵懶，納差，尿少，大便秘結，體質量減少，呼吸急促，表明建立的心力衰竭大鼠模型符合氣虛血瘀證證候特點。

補腎活血復方以“腎藏精主水”理論為指導組方：菟絲子補肝腎、固精，黃精補氣養(yǎng)陰、益腎健脾，丹參活血祛瘀、益心通經(jīng)，三者補腎活血，共為君藥；龜甲膠滋陰潛陽、益腎健骨，增強菟絲子和黃精補腎之功，紅花與三七活血不留瘀，助丹參活血祛瘀，共為臣藥；人參、黃芪補元氣、補心腎，人參還可生津止渴，黃芪利尿消腫，二者為佐藥；益母草破瘀通脈、利水消腫，為使藥。治本虛宜補腎益心，除標實宜活血利水，以上諸藥共奏此功效。托伐普坦是血管升壓素V2受體拮抗劑，屬新型排水利尿劑，可調節(jié)水鈉代謝，用于治療頑固性難治性心力衰竭，尤其適用于合并利尿劑抵抗和水電解質紊亂患者，故本研究將其作為陽性對照藥物[20]。本實驗對模型大鼠用藥4周后，補腎活血組大鼠毛色光澤逐漸恢復，精神良好，活動量、飲食、體質量均有改善，無喘促等癥狀，說明補腎活血復方可改善大鼠心力衰竭體征。且補腎活血組大鼠血清NT-proBNP含量減少，左心室ESD、EDD明顯減小，EF、FS明顯增加，說明補腎活血復方具有改善心室結構及心功能作用。HE染色顯示，補腎活血組較模型組顯著改善，大鼠心肌纖維排列較整齊，部分心肌纖維斷裂、壞死，細胞核位于細胞邊緣，極少細胞核固縮、碎裂，說明補腎活血復方可抑制心室重構，改善心肌結構，與托伐普坦組療效相當。

從現(xiàn)代醫(yī)學角度分析，心肌梗死后心排出量降低，反射性激活神經(jīng)-內分泌系統(tǒng)，促進心室重構，引發(fā)心力衰竭，此時胃腸黏膜缺血缺氧造成胃腸道屏障損傷，腸道水液代謝紊亂、液體潴留，腸道吸收分泌功能受損，加重心力衰竭進程[21]。因此，胃腸道既是心力衰竭過程中易損傷的靶器官，又是誘發(fā)病情進展的始動器官[22]。研究顯示，AQP4表達異常影響心肌梗死或心力衰竭大鼠心臟和結腸組織水液代謝平衡[23]。AQP是一組跨細胞膜轉運的水通道蛋白，廣泛存在于心臟及腸道組織，其中AQP4主要存在于結腸上皮細胞基底外側膜[24]和心肌細胞膜[25]。在急性心肌梗死狀態(tài)，細胞內鈉鹽含量升高，滲透壓增加，細胞膜AQP4表達升高，水鈉潴留于細胞內，細胞腫脹，心肌水腫，急性期引發(fā)心力衰竭，慢性期發(fā)生心肌纖維化[4]。當結腸發(fā)生炎癥和損傷時，AQP4表達顯著降低，水液代謝紊亂[26]。本研究結果顯示，模型組大鼠結腸黏膜上皮排列紊亂，杯狀細胞較少，大量淋巴細胞浸潤，心肌組織AQP4表達上調，結腸組織AQP4表達下調；應用托伐普坦和補腎活血復方干預后，大鼠結腸黏膜上皮完整且排列整齊，杯狀細胞增多，偶見少量淋巴細胞，心肌組織AQP4表達下調，結腸組織AQP4表達上調，說明補腎活血復方可能通過調控AQP4表達，調節(jié)心肌及結腸水液代謝。

綜上所述，補腎活血復方可能通過調節(jié)心肌和結腸組織AQP4蛋白表達改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心室重構及心功能，其具體分子機制有待進一步探究。