徐雅倩 ，陳博威 ，田豐銘 ，劉英飛 ，易健 ，劉柏炎

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；

2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410203；

3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006

缺血性腦卒中是嚴重危害人類健康的腦血管疾病之一[1]，血管新生是促進缺血性腦卒中神經(jīng)功能恢復的重 要 途 徑[2]。N6-甲 基 腺 苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是存在于高級真核生物RNA中的最普遍的修飾之一，RNA的m6A修飾在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理病理過程中起著重要的生物學作用[3]。補陽還五湯是治療缺血性中風的有效方劑，但其治療腦缺血的分子機制仍待進一步闡明。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白1（Cav-1）可能是補陽還五湯治療腦缺血的潛在靶點[4-6]，但Cav-1對腦缺血后m6A修飾的影響鮮見報道。本研究以Cav-1基因敲除（Cav-1-/-）小鼠為研究對象，觀察補陽還五湯對Cav-1-/-小鼠腦缺血后m6A修和血管新生的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級雄性Cav-1-/-（KO）小鼠與同源野生型（WT）C57BL/6小鼠各36只，6～8周齡，體質(zhì)量23～28 g。Cav-1-/-小鼠引種自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，由課題組長期飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，小鼠子代經(jīng)PCR鑒定為KO小鼠與同源WT 小鼠后納入實驗。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（ZYFY20201215-1）。

1.2 藥物

補陽還五湯由黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花按120∶6∶4.5∶3∶3∶3∶3比例組成，飲片購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。常規(guī)浸泡、煎煮后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原藥材濃度2 g/mL。濃縮液經(jīng)課題組前期UPLC-Q-TOF-MS檢測，黃芪甲苷Ⅳ、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內(nèi)酯苷濃度分別為78.1、46.7、45.6、468.4 μg/mL[7]。

1.3 主要試劑與儀器

m6A 甲基化測定試劑盒（英國Abcam，貨號ab185912），兔抗血管性血友病因子（VWF）抗體（英國Abcam，貨號ab216566），小鼠抗增殖相關Ki-67抗體（武漢博士德，貨號M00254-9），RNA抽提試劑盒（北京碧云天，貨號R0026）。智能組織切片成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer，型號Vectra3），熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf，型號Realplex2）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥

將KO小鼠和WT小鼠按隨機數(shù)字表法分別分為對照組、模型組和補陽還五湯組，每組12只。采用大腦中動脈栓塞法復制腦缺血模型。將小鼠麻醉后固定，取頸正中切口，鈍性分離左側頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，將線栓經(jīng)頸總動脈送入頸內(nèi)動脈，當線栓上黑色標記點恰好位于頸總動脈分叉時固定線栓，消毒并縫合皮膚。對照組小鼠僅切開皮膚游離血管，隨后縫合皮膚。術后2 h參照Longa法[8]對小鼠進行神經(jīng)行為學評分，評分1～3分為模型復制成功。

根據(jù)前期研究[4，6]，確定補陽還五湯給藥劑量為18.5 g/kg。補陽還五湯組于成模后給藥，模型組及對照組給予等體積蒸餾水，灌胃體積均為0.2 mL/10 g，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2 神經(jīng)行為學評分

腦缺血后第7日是血管新生黃金期[2，9]，因此，于第7日進行神經(jīng)行為學評分。末次給藥2 h后，采用Levy A 14分評分法[10]對小鼠神經(jīng)行為學進行評分。

2.3 取材

神經(jīng)行為學評分后腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頭分離全腦，每組隨機選取6只進行病理學及免疫熒光檢測，剩余6 只進行m6A 水平及RT-qPCR檢測。

2.4 m6A水平檢測

提取缺血側皮質(zhì)總RNA，向各孔中加入200 ng總RNA，并根據(jù)m6A甲基化試劑盒說明書分別加入相應試劑，于酶標儀波長450 nm處讀取各孔吸光度，比色法檢測m6A水平。

2.5 HE染色

腦組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、包埋及切片，以蘇木素-伊紅染色，封片后使用智能組織切片成像系統(tǒng)進行全片掃描。

2.6 免疫熒光雙標染色

采用免疫熒光雙標法檢測VWF/Ki-67雙標陽性細胞數(shù)，VWF標記血管內(nèi)皮細胞，Ki-67標記增殖細胞，VWF/Ki-67雙標陽性細胞表示新生的血管內(nèi)皮細胞。取全腦組織石蠟切片，依次脫蠟、抗原修復及封閉，分別加入VWF一抗（1∶100）、Ki-67一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，滴加熒光二抗，避光孵育1 h，PBS沖洗后滴加DAPI染色液，繼續(xù)孵育10 min，PBS沖洗后甘油封片。使用智能組織切片成像系統(tǒng)進行全片掃描，運用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算單位面積陽性細胞數(shù)。

2.7 RT-qPCR檢測

取30 mg缺血側皮質(zhì)置于1.5 mL離心管中，迅速加入預冷裂解液600 μL，用微型電動勻漿器勻漿，通過離心柱法抽提RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）、腎母細胞瘤1相關蛋白（WTAP）、肥胖相關蛋白（FTO）及AlkB 同系物5（ALKBH5）mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 補陽還五湯對小鼠神經(jīng)行為學評分的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠神經(jīng)行為學評分明顯升高（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO補陽還五湯組小鼠神經(jīng)行為學評分明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與WT模型組比較，KO模型組神經(jīng)行為學評分明顯升高（P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組神經(jīng)行為學評分明顯升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)行為學評分比較（±s，每組12只）

4.2 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質(zhì)m6A水平的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A水平明顯上升（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO 補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A水平明顯下降（P＜0.01）；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A水平明顯升高（P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A水平明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A水平比較（±s，每組6只）

4.3 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質(zhì)病理形態(tài)的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元排列不規(guī)整，細胞間隙增寬，存在空泡，細胞核出現(xiàn)固縮；與同基因型模型組比較，WT、KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對規(guī)整，細胞間隙減小，核仁較清晰；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)大量核固縮及空泡；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對欠規(guī)整，存在更多空泡。見圖3。

圖3 各組小鼠缺血側皮質(zhì)形態(tài)（HE染色，×400）

4.4 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質(zhì)血管新生的影響

與同基因型對照組比較，WT、KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)VWF/Ki-67 雙標陽性細胞數(shù)明顯增加（P＜0.01）；與同基因型模型組比較，WT、KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)雙標陽性細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)雙標陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)雙標陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠缺血側皮質(zhì)VWF/Ki-67雙標陽性細胞（免疫熒光染色，×400）

圖5 各組小鼠缺血側皮質(zhì)VWF/Ki-67雙標陽性細胞數(shù)比較（±s，每組6只）

4.5 補陽還五湯對小鼠缺血側皮質(zhì)m6A 甲基化酶mRNA表達的影響

與同基因型對照組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)WTAP mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），WT、KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)FTO和ALKBH5 mRNA表達明顯下降（P＜0.01）；與WT模型組比較，KO模型組小鼠缺血側皮質(zhì)WTAP mRNA表達明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)TO 和ALKBH5 mRNA 表達明顯下降（P＜0.01，P＜0.05）；與同基因型模型組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)WTAP mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），WT、KO 補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)FTO 和ALKBH5 mRNA 表達明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與WT補陽還五湯組比較，KO補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)FTO 和ALKBH5 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）。各組METTL3和METTL14 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A甲基化酶mRNA表達比較（±s）

表2 各組小鼠缺血側皮質(zhì)m6A甲基化酶mRNA表達比較（±s）

ALKBH5 1.01±0.08 0.60±0.10**0.75±0.08#0.99±0.08 0.44±0.11**▲0.60±0.07#◇◇組別WT對照組WT模型組WT補陽還五湯組KO對照組KO模型組KO補陽還五湯組只數(shù)6 6 6 6 6 6 METTL3 1.01±0.04 1.08±0.23 0.99±0.24 1.01±0.07 1.05±0.13 0.99±0.15 METTL14 0.99±0.06 1.09±0.20 0.94±0.24 0.97±0.10 1.04±0.10 1.06±0.16 WTAP 0.99±0.11 1.06±0.21 1.01±0.15 1.00±0.07 1.34±0.11**▲1.16±0.07##FTO 1.00±0.10 0.48±0.09**0.70±0.11##0.98±0.08 0.30±0.06**▲▲0.52±0.08##◇◇

5 討論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)學“中風”范疇，多因風、痰、瘀、火留滯經(jīng)絡，氣血運行不暢所致，氣虛血瘀是中風病重要的病理因素[11]。補陽還五湯為治療中風病氣虛血瘀證的代表方，其君藥黃芪有消瘀不傷正之效，臣以當歸尾化瘀不傷血，佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花活血祛瘀，地龍通絡。全方具備補氣為先，祛瘀為輔，標本兼顧之特點。課題組既往研究表明，補陽還五湯能夠通過多途徑、多通路、多靶點發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用[12-13]。

腦缺血后缺血半暗區(qū)血流的恢復有賴于側支循環(huán)的建立，新形成的側支血管可明顯改善缺血區(qū)周圍組織灌流，血管新生通過啟動損傷區(qū)微血管網(wǎng)重建，為損傷神經(jīng)元修復、突觸重建和神經(jīng)發(fā)生創(chuàng)造良好的微環(huán)境[9，14]。臨床研究顯示，腦梗死患者腦組織血管密度與腦卒中預后呈正相關[2]。本研究中，小鼠在腦缺血后有一定的血管內(nèi)皮細胞新生，但新生細胞數(shù)量有限。補陽還五湯干預能顯著提高缺血側皮質(zhì)新生血管內(nèi)皮細胞的數(shù)量，提示補陽還五湯能夠促進腦缺血后血管新生。

m6A修飾是一種動態(tài)的表觀遺傳修飾，不僅影響mRNA的穩(wěn)定性，還能影響mRNA的翻譯潛能[15]。本研究顯示，缺血側皮質(zhì)m6A水平較同基因型對照組顯著升高，與既往研究結果[16]一致。m6A修飾是動態(tài)且可逆的，由甲基化轉(zhuǎn)移酶安裝，去甲基化酶刪除。為此，本研究檢測5種常見的m6A甲基化酶的表達水平，發(fā)現(xiàn)KO模型組小鼠缺血皮質(zhì)區(qū)WTAP表達上調(diào)，WT及KO模型組小鼠FTO和ALKBH5表達下調(diào)，補陽還五湯能逆轉(zhuǎn)上述變化，但METTL3和METTL14甲基化轉(zhuǎn)移酶表達未見明顯變化。WTAP是一種m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，其高表達可能導致m6A水平上升[17]，目前其與腦缺血相關的報道較少，有待進一步研究。FTO是一種m6A去甲基化酶，在腦內(nèi)有豐富的表達[18]。有研究表明，F(xiàn)TO在腦缺血皮質(zhì)神經(jīng)元中特異性下調(diào)[19]，在梗死心肌細胞中FTO的表達也下調(diào)[20]，表明缺血損傷中FTO普遍呈低表達。而過表達FTO可減輕腦缺血導致的神經(jīng)元凋亡[16]。ALKBH5也是一種m6A去甲基化酶，既往研究表明，在缺氧復氧處理的神經(jīng)元中敲除ALKBH5會加重神經(jīng)元損傷[16]。此外，ALKBH5能夠去甲基化B 淋巴細胞瘤-2（BCL2），防止BCL2 mRNA降解，并抑制神經(jīng)元凋亡[21]。推測補陽還五湯可能通過影響m6A修飾，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

細胞膜小窩是細胞膜上的特殊凹陷，是各類細胞信號分子的聚集地，在血管內(nèi)皮細胞及神經(jīng)元中有豐富的表達。Cav-1是小窩中重要的功能結構與核心蛋白，其不僅參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，也能調(diào)節(jié)血腦屏障通透性、炎癥、血管新生和神經(jīng)再生等參與腦缺血損傷[22]。研究表明，過表達Cav-1可明顯促進內(nèi)皮細胞分化并上調(diào)毛細血管樣管狀結構數(shù)量，沉默Cav-1表達則導致毛細血管樣管狀結構數(shù)量減少，提示Cav-1可能在腦缺血后的血管新生過程中發(fā)揮重要作用[23]。此外，研究表明，Cav-1可能與m6A水平密切相關，如Cav-1對于FTO敲低細胞的增殖和轉(zhuǎn)移至關重要，F(xiàn)TO能夠通過Cav-1影響細胞的能量代謝水平[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然各組WT小鼠WTAP表達無明顯變化，但KO模型組小鼠WTAP表達上調(diào)，提示在腦缺血后Cav-1可能通過調(diào)控WTAP表達，影響m6A修飾的RNA甲基化水平，其機制有待進一步研究。同時，KO模型組及KO補陽還五湯組與各自WT組相比，F(xiàn)TO和ALKBH5表達下降，提示在腦缺血后Cav-1可能通過影響去甲基化酶FTO及ALKBH5，調(diào)控m6A水平。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能夠促進腦缺血后神經(jīng)功能恢復及血管新生，降低病理形態(tài)損傷及m6A修飾的RNA甲基化水平，但KO小鼠的神經(jīng)功能恢復、病理形態(tài)改善、新生血管內(nèi)皮數(shù)目及RNA甲基化水平不及WT組。

綜上所述，Cav-1缺失會抑制腦缺血后血管新生，加劇m6A水平失調(diào)。補陽還五湯可能通過Cav-1調(diào)控腦缺血小鼠m6A修飾的RNA甲基化水平，促進血管新生。本研究同時從Cav-1及m6A修飾角度探討補陽還五湯促進腦缺血后血管新生的機制，可為補陽還五湯的表觀轉(zhuǎn)錄機制研究提供新思路。