段妍琴，劉勝蘭，劉瑞連，屈彬清，譚電波，劉春海，劉東亮

（1.湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院/長沙市第四醫(yī)院，湖南 長沙 410006；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；4.湖南省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)基礎(chǔ)研究所，湖南 長沙 410006）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳殼具有調(diào)節(jié)胃腸蠕動、抗菌、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、保肝、抗休克等作用[2-3]。枳殼主要成分包括黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油和生物堿類等[4-6]。黃酮類化合物為枳殼主要有效成分，包括柚皮苷、新橙皮苷等，具有抗菌、抗病毒、抑制毛細(xì)血管脆性等多種生物活性[7-10]。香豆素類成分以橙皮內(nèi)酯為代表，對調(diào)節(jié)胃腸運動的乙酰膽堿酯酶有明顯抑制作用[11]。揮發(fā)油中以檸檬酸為主要成分[12]，可發(fā)揮升血壓、調(diào)節(jié)胃腸運動、擴(kuò)張氣管等作用[13]。枳殼是常見的調(diào)節(jié)內(nèi)臟功能的藥食兩用藥材，在中國、日本、韓國等亞洲地區(qū)臨床應(yīng)用廣泛[14-15]。

枳殼炮制歷史悠久，生品燥性較強[16-17]，其醋制能引藥入肝，增強散瘀止痛、開胃養(yǎng)肝的功效[18]；麩炒具有去燥和胃的作用[19]；鹽制后能增強一些藥物的溶解度，引起鹽炙前后藥效和吸收代謝的變化[20]。中藥炮制后臨床療效會發(fā)生變化，但目前關(guān)于枳殼炮制前后化學(xué)成分變化的研究還不夠全面，多見麩炒品炮制前后研究[21-23]，對枳殼醋制、鹽制及水潤的研究較少，在一定程度上限制了其炮制品的推廣應(yīng)用[24-26]。

2020年版《中華人民共和國藥典》僅以同時測定柚皮苷和新橙皮苷兩個黃酮類化合物的含量來控制枳殼的質(zhì)量，不能反映炮制前后質(zhì)量的全貌。因此，本研究選擇枳殼中8種主要黃酮類成分（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桔皮素、川陳皮素、枸橘苷、甜橙黃酮）和2種主要香豆素類成分（橙皮內(nèi)酯和橙皮油素），建立一個合理而有效的多成分含量分析方法，測定枳殼炮制前后（生品、麩炒、醋炙、水潤、鹽炙）成分含量的變化，旨在為枳殼及其炮制品質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XS205DU十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；CP224C型分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；KQ5200DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Millipore S.A.S.67120 Moisheim超純水系統(tǒng)。

1.2 試藥 蕓香柚皮苷對照品（批號：MUST-16030408）購于成都曼斯特生物科技有限公司；柚皮苷對照品（批號：10552-201301）、橙皮苷對照品（批號：10089-201203）、新橙皮苷對照品（批號：10477-201203）均購于南昌貝塔生物科技有限公司；橙皮內(nèi)酯（批號：23971-42-8）、枸橘苷對照品（批號：14941-08-3）、甜橙黃酮對照品（批號：2306-27-6）、川陳皮素對照品（批號：MUST-16070901）、桔皮素對照品（批號：481-53-8）、橙皮油素（批號：495-02-3）均購于寶雞市辰光生物科技有限公司，以上試藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；色譜純乙腈、甲醇均購于德國默克股份有限公司；磷酸為分析純，水為超純水。枳殼藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龔力民老師鑒定為正品，均為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實。（見表1）

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，82%A →75%A；15 ～40 min，75%A →40%A；40 ～50 min，40%A→5%A；50～60 min，5%A；60～60.1 min，5%A→82%A），流速：1.0 mL/min；變換波長檢測：0～5 min，318 nm；5～19 min，300 nm；19～21 min，320 nm；21～31 min，285 nm；31～60 min，324 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素和橙皮油素對照品適量，分別加甲醇稀釋成含蕓香柚皮苷100.00 μg/mL、柚皮苷420.00 μg/mL、橙皮苷32.12 μg/mL、新橙皮苷260.00μg/mL、橙皮內(nèi)酯42.75μg/mL、枸橘苷52.50 μg/mL、甜橙黃酮26.00 μg/mL、川陳皮素32.00 μg/mL、桔皮素31.50 μg/mL和橙皮油素25.20 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 枳殼炮制品的制備

2.3.1 生品 隨機(jī)取枳殼原藥材樣品（湖南安仁、湖南石門），參考2020年版《中華人民共和國藥典》枳殼飲片的炮制要求，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切薄片（1～2mm），干燥后篩去碎落的瓤核。

2.3.2 麩炒 先用中火將鍋預(yù)熱，將麥麩均勻撒入鍋中，待冒出大量濃煙時，隨即投入枳殼片（“2.3.1”項生品炮制飲片），迅速翻動，炒至枳殼表面呈艷黃色時迅速出鍋，取出，篩去麩皮，放涼。每100 g枳殼用麥麩10 g。

2.3.3 醋炙 隨機(jī)取枳殼片（“2.3.1”項生品炮制飲片），加米醋拌勻，悶透，至醋被吸盡，置炒制容器內(nèi)（藥量不超過鍋高度的2/3），用文火（小火）加熱，采用八字法翻炒，炒至藥物近干時出鍋，取出，放涼。每100 g枳殼用陳醋30 g。

2.3.4 水潤 稱取石門枳殼原藥材300 g，水噴灑枳殼原藥材，蓋上保鮮膜，潤15 h。將水潤的石門枳殼切成1～2 mm薄片，置于40 ℃的烘箱內(nèi)干燥10 h，干燥后篩去碎落的瓤核。

2.3.5 鹽炙 隨機(jī)取枳殼片（“2.3.1”項生品炮制飲片），加鹽水悶12 h，切1 mm厚的片，置于鍋內(nèi)，采用八字法翻炒，炒至藥物近干時出鍋，取出，放涼。每100 g枳殼用食鹽1 g，水適量（一般為鹽的4～5倍）。

2.4 供試品溶液制備 精密稱取枳殼粗粉（過二號篩）與其炮制品各0.5 g（藥材信息見表2），將其置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，精密稱定，超聲提取45 min，取出，放涼，稱質(zhì)量，用甲醇補齊質(zhì)量，搖勻，過0.45μm濾膜，取其續(xù)濾液，即得。

表2 藥材信息表

2.5 專屬性試驗 按照“2.1”項下色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液進(jìn)行測定。結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分色譜峰分離度理想，理論塔板數(shù)均＞5 000，分離度均＞1.5，顯示了良好的專屬性。

圖1 混合對照品溶液（A）、供試品溶液（B）的HPLC 圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系的考察 分別精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素和橙皮油素對照品溶液適量，加入甲醇進(jìn)行稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。將上述不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件下進(jìn)樣，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 10 種成分的回歸方程及線性范圍

2.6.2 精密度試驗 取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素和橙皮油素峰面積的RSD值（n=6）分別為1.39%、1.40%、1.36%、1.42%、1.42%、1.29%、1.09%、1.04%、1.05%、0.71%，均＜3%，結(jié)果儀器顯示精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取同一供試品溶液10 μL（S1：湖南安仁），按“2.1”項下色譜條件，于0、1、2、4、8、24 h進(jìn)樣測定，測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素和橙皮油素峰面積RSD值分別為2.33%、2.29%、1.04%、2.48%、2.57%、2.75%、1.81%、2.52%、2.44%、1.34%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗 取同一樣品6份（S1：湖南安仁），按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮內(nèi)酯、枸橘苷、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素和橙皮油素的含量RSD值分別為1.75%、1.81%、2.19%、2.06%、2.42%、2.12%、2.26%、2.43%、2.73%、1.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量藥材6份（S1：湖南安仁），每份0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入各對照品溶液適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算平均加樣回收率和RSD值。（見表4）

表4 各成分加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.7 樣品含量測定 取已制備好的7份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，并根據(jù)外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表5～7。對比情況見圖2～4。由表7與圖2可知，枳殼經(jīng)麩炒后，主要成分含量顯著增加；采用不同輔料炮制時，化學(xué)成分變化差異較大。蕓香柚皮苷的含量變化是：水潤＞鹽炙＞麩炒＞醋炙＞生品；柚皮苷的含量變化是：水潤＞鹽炙＞麩炒＞醋炙＞生品；橙皮苷的含量變化是：水潤＞麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品；新橙皮苷的含量變化是：水潤＞麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品；枸橘苷的含量變化是：水潤＞麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品；橙皮內(nèi)酯的含量變化是：麩炒＞鹽炙=醋炙＞生品＞水潤；甜橙黃酮的含量變化是：麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品=水潤；川陳皮素的含量變化是：麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品＞水潤；桔皮素的含量變化是：麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品＞水潤；橙皮油素的含量變化是：麩炒＞鹽炙=醋炙＞生品＞水潤。

圖2 不同炮制品枳殼（湖南安仁）中主要成分含量柱狀圖

圖3 不同炮制品枳殼（湖南石門）中主要成分含量柱狀圖

圖4 不同炮制品枳殼中黃酮類成分含量3D 柱狀圖

表5 不同炮制方法的枳殼藥材中主要成分含量測定結(jié)果 （mg/g）

表6 不同炮制品枳殼（湖南安仁）中主要成分含量 （%）

表7 不同炮制品枳殼（湖南石門）中主要成分含量 （%）

3 討論

3.1 提取時間選擇 本研究考察了不同提取時間對提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取45 min時，樣品中各成分的含量提取完全，延長提取時間，沒有顯著提高成分的提取量，因此采用超聲提取45 min的方法制備供試品溶液。

3.2 色譜條件選擇 本研究分別將10種對照品溶液于紫外檢測器下進(jìn)行波長掃描，檢測其最大吸收波長，確定了變換波長檢測的方法，并且對供試品提取時間及色譜條件柱溫和流速進(jìn)行了優(yōu)化，確定了本研究的色譜條件。

4 結(jié)論

2020年版《中華人民共和國藥典》一部規(guī)定枳殼中含柚皮苷不得少于4.0%，新橙皮苷不得少于3.0%。本研究中所有樣品均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。本研究對枳殼飲片采用不同炮制方法，對其主要黃酮類成分的含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，炮制品中黃酮類成分的含量大多較生品含量高，其中，比較不同炮制方式對各成分的影響，烘制＞炒制，比較輔料對各成分的影響時蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷的含量變化通常是：水潤＞麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品；而橙皮內(nèi)酯、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素的含量變化通常為：麩炒＞鹽炙=醋炙＞生品＞水潤?？梢姴煌o料進(jìn)行枳殼炮制時，對不同的成分影響較大，呈現(xiàn)不同的變化趨勢，特別是對其含量較高的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷的含量變化呈現(xiàn)相同的變化趨勢：水潤＞麩炒＞鹽炙＞醋炙＞生品；輔料可促進(jìn)這些成分的合成，使其含量升高，從而改變其藥理活性。

本研究建立了HPLC法測定枳殼炮制前后10種成分含量。該方法簡便、可行，為枳殼及其炮制品質(zhì)量評價提供了依據(jù)，為闡明枳殼藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)。