劉 倩，黃藝曉，臧二歡，張明旭，李旻輝,2,3

（1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)藥研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.）又名達(dá)烏里龍膽、達(dá)烏里秦艽，為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬[Gentiana（Tourn.）L.]植物。其作為藥材秦艽的基原植物收錄于2020年版《中華人民共和國藥典》[1]中。小秦艽根略成紡錘形或圓柱形，長8～20 cm，直徑0.2～1.0 cm；表面棕黃色或棕褐色，有縱向或扭曲的縱溝紋；主根通常為一個(gè)或分成數(shù)枝[2]。小秦艽具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效，如與石膏、知母、花粉、枳實(shí)等配伍，可清熱除煩，潤腸通便[3]，有極高的藥用價(jià)值。小秦艽作為蒙醫(yī)臨床常用藥，在內(nèi)蒙古地區(qū)分布較廣，但因其種子萌發(fā)率低和過度采挖，資源儲(chǔ)備情況不容樂觀[4-6]。目前其正面臨著野生資源急速萎縮、棲息地被破壞、種植地不合理[7]及遺傳多樣性喪失等問題。小秦艽早在1987年被認(rèn)證為三級(jí)國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種，故加強(qiáng)小秦艽種質(zhì)資源的研究及保護(hù)，以實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)開發(fā)利用已刻不容緩。

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8-9]，而核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）是植物類DNA條形碼鑒定的熱門候選序列[10]。ITS由核DNA中nrDNA的18S與5.8S、26S間的兩個(gè)基因間區(qū)（ITS1、ITS2）組成[11-12]。ITS區(qū)不加入成熟核糖體，表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性[13]，同時(shí)其在長度上具有較好的保守性，適合于植物屬、種級(jí)的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究[14]。以ITS區(qū)作為分子鑒定手段，研究藥用植物的遺傳進(jìn)化已有較為成熟的體系[15-16]。裴香萍等[17]通過ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對酸棗仁藥材進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明不同來源的酸棗仁聚為一支，偽品枳椇子單獨(dú)聚為一支，呈現(xiàn)出明顯的單系性，且各正品酸棗仁與偽品枳椇子間的遺傳距離明顯大于酸棗仁各正品之間的遺傳距離。因此，通過ITS序列進(jìn)行建樹能夠成功鑒別酸棗仁及其偽品枳椇子。邱智敏等[18]通過分析和比較秋茄樹的ITS序列，研究不同引種居群間的遺傳分化和變異情況，揭示秋茄樹的遺傳多樣性水平隨緯度升高而增加，由此可闡明不同地理區(qū)域環(huán)境對秋茄樹適應(yīng)性分化的影響。本實(shí)驗(yàn)利用ITS序列分析內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地、不同生長環(huán)境的小秦艽樣品的遺傳多樣性，以期對小秦艽種質(zhì)資源的保護(hù)和發(fā)展提供一定的參考價(jià)值。

1 材料

1.1 小秦艽樣品 采集內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地的野生小秦艽樣品共62份，經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院張春紅教授鑒定為龍膽科龍膽屬植物小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.），采集的新鮮樣品經(jīng)硅膠干燥后保存待測。樣品采集信息見表1。

表1 小秦艽樣品采集地信息

1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（批號(hào)：W9909）、TIANSeq高保真PCR反應(yīng)預(yù)混液（NG219）（批號(hào)：X0725）、50×TAE Buffer（批號(hào)：X0414）均購自天根生化（北京）科技有限公司；GelStain核酸染色劑（10 000×水溶液）（批號(hào)：20210702）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Agarose瓊脂糖（EZ3454B228）購自廣州賽國生物科技有限公司；DL1000 DNA Marker（批號(hào)：3591A）購自TaKaRa公司；巰基乙醇（批號(hào)：M8210）、氯仿（批號(hào)：20220114）均購自福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（批號(hào)：20211018）購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3 儀器 Tone 96G型PCR擴(kuò)增儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；H3018DR型高速冷凍離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；JX-10型干式恒溫器金屬浴（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；OD-1000分光光度計(jì)（One Drop）、GoodSee-5型薄層色譜成像儀（上?？普苌萍加邢薰荆?704482水平電泳儀（BIO-RAD）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多公司）；KJXH-Ⅱ型旋渦混合器（江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 DNA提取 取小秦艽樣品（全草）約35 mg，加入液氮充分碾磨；采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

2.2 DNA濃度檢測 取1 μL已提取的DNA溶液樣品，用分光光度計(jì)測定所提取的DNA的濃度。

2.3 PCR擴(kuò)增

2.3.1 引物 本研究使用的引物ITS2（5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’）和ITS3（5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司定制合成。引物稀釋至10 μmol/L。

2.3.2 反應(yīng)體系 反應(yīng)體系體積為25 μL，其中DNA模板1 μL，正、反引物各1 μL，TIANSeq高保真PCR反應(yīng)預(yù)混液（NG219）12.5 μL，并用ddH2O補(bǔ)足剩余體積。

2.3.3 循環(huán)參數(shù) 通過前期實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)條件的多次考察，最終確定94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃延伸30 s，68 ℃復(fù)性15 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃5 min；4 ℃保存30 min。

2.4 電泳 取1.0 g Agarose溶解于100 mL的1×TAE Buffer，于60 ℃加入10 μL的GelStain核酸染色劑（10 000×水溶液），混勻，冷卻；用1%的瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物和Marker各5 μL，點(diǎn)樣，于160 V、400 mA條件下電泳35 min。

2.5 PCR產(chǎn)物測序 將PCR產(chǎn)物測序，產(chǎn)物均由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，每個(gè)樣品均采用正、反雙向測序。

2.6 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 用Bio Edit軟件查看測序峰圖，核對前后截取位點(diǎn)；再用CLC Sequence Viewer 8軟件查看結(jié)果序列并轉(zhuǎn)化格式；最后用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）11.0軟件進(jìn)行多重序列比對，根據(jù)Kimura-2-parameter（K2P）計(jì)算遺傳距離，采用鄰位相接法（NJ法）利用樣品ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.7 龍膽苦苷含量測定 前期課題組對相似采樣點(diǎn)的小秦艽樣品進(jìn)行含量測定分析，方法依照2020年版《中華人民共和國藥典》一部秦艽中龍膽苦苷高效液相色譜法含量測定的要求。

3 結(jié)果

3.1 各樣品DNA濃度 采集的各樣品提取的DNA濃度見表2。

表2 DNA 濃度檢測表

續(xù)表2：

3.2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 采集的各樣品PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖1。

圖1 小秦艽樣品凝膠電泳圖

3.3 序列分析 測得的62條序列中恒定位點(diǎn)（C）、變異位點(diǎn)（V）、簡約信息位點(diǎn)（Pi）和單態(tài)位點(diǎn)（S）的個(gè)數(shù)分別為318、129、75和54，其中變異位點(diǎn)占28.79%（129/448）。根據(jù)MEGA11.0軟件分析結(jié)果顯示，所有樣品總位點(diǎn)數(shù)（Number Sites）為448。

3.4 遺傳距離 通過MEGA 11.0軟件檢測不同產(chǎn)地的小秦艽ITS2基因序列的遺傳距離，種內(nèi)遺傳距離范圍為0.000 0～0.263 2，平均種內(nèi)遺傳距離為0.049 4。

3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)NJ樹結(jié)果顯示，62份小秦艽樣品分為兩支，編號(hào)為BT1（采自包頭市白云鄂博巴潤園區(qū)東南1 km處）和BY1（采自巴彥淖爾盟烏拉特前旗阿嘎如泰蘇木大樺背）的樣品聚為一個(gè)小分支，其余60份樣品聚為一個(gè)大的分支。通過ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 ITS2 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

3.6 樣品龍膽苦苷含量比較分析 根據(jù)課題組小秦艽前期實(shí)驗(yàn)研究中相似采樣點(diǎn)樣品的主要有效成分龍膽苦苷含量，比較發(fā)現(xiàn)聚在小分支上的BTI和BY1有相似的龍膽苦苷含量；同樣的，聚在另一大支上的WL1、CF9、XL6、XL2、BT9、XL1、HH13、BT5、BT4、WL3、HH14、WL9、WL2和CF1的龍膽苦苷含量相似。具體樣品含量見表3。

表3 小秦艽樣品中龍膽苦苷含量

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了62份內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地的小秦艽樣品的ITS序列，探索其在不同地理環(huán)境下的遺傳變異情況。從NJ樹上來看，編號(hào)為BT1（采自包頭市白云鄂博巴潤園區(qū)東南1 km處）和BY1（采自巴彥淖爾盟烏拉特前旗阿嘎如泰蘇木大樺背）的樣品聚為一支，說明有較近的親緣關(guān)系。深入分析這兩份樣品的序列，可以發(fā)現(xiàn)BTI和BY1有46個(gè)相同的變異位點(diǎn)，占各自變異位點(diǎn)的48.4%（46/95）和85.2%（46/54）；二者有3個(gè)特征變異位點(diǎn)，分別為104 bp-G，155 bp-G，251 bp-A。在相似的遺傳變異條件下，以張明旭等[5]內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地小秦艽中主要有效成分龍膽苦苷含量測定結(jié)果為參考，發(fā)現(xiàn)BTI和BY1有相似的龍膽苦苷含量；同樣的，聚為另一大支的小秦艽樣品中WL1、CF9、XL6、XL2、BT9、XL1、HH13、BT5、BT4、WL3、HH14、WL9、WL2和CF1的龍膽苦苷含量相似。然而，影響貢獻(xiàn)率較大的生態(tài)因子在各個(gè)樣品中存在顯著差異，進(jìn)一步排除生態(tài)環(huán)境對于龍膽苦苷含量的影響，由此推測小秦艽主要有效成分龍膽苦苷的含量可能與遺傳變異過程相關(guān)。

樣品BT1和HH4（采自呼和浩特市和林格爾縣太平夭），BT1和AL1（采自阿拉善左旗巴潤別立鎮(zhèn)賀蘭山雪嶺子溝）遺傳距離最大，均為0.236 2，說明其存在明顯的遺傳變異差異。考慮地理距離較大的原因，推測地理環(huán)境因素在一定程度上影響了小秦艽的生物進(jìn)化過程。這樣的推測也被研究證實(shí)，如張明旭等[7]采用增強(qiáng)回歸樹模型對內(nèi)蒙古小秦艽的生態(tài)適宜區(qū)進(jìn)行了模擬，研究影響其生長的生態(tài)因子，結(jié)果表明，海拔和土壤類型對于小秦艽的生長分布有顯著的影響。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，可看出在同一地域生長的樣品并不一定包含在同一個(gè)分支內(nèi)，不同地域生長的樣品也可能包含在同一個(gè)分支中，表明不同的小秦艽樣品之間存在遺傳的變異，但是差異并不顯著。不同產(chǎn)地的小秦艽樣品存在一定程度的基因交流，但并不完全按照地理分布聚類。除了地理因素之外，還有許多因素影響著生物的遺傳與進(jìn)化，還需進(jìn)一步的研究和探索[19]。

遺傳多樣性使物種進(jìn)化潛力和生物多樣性得到了相對有效的保障。一般情況下，遺傳變異越豐富，適應(yīng)環(huán)境的能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍[20]。在漫長的演化過程中，多種因素會(huì)影響物種的遺傳多樣性，自然選擇及繁育系統(tǒng)等都是導(dǎo)致種群遺傳變異的重要因素之一[21]。因此，選擇DNA分子技術(shù)—ITS序列有助于研究藥用植物小秦艽種質(zhì)資源遺傳多樣性，了解種內(nèi)遺傳變異的大小及其與環(huán)境的關(guān)系，從而保護(hù)及發(fā)展小秦艽種源優(yōu)勢。