張萬祥，劉 浩，王 龍，張水寒

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009）

楝葉吳萸Euodia glabrifolia（Champ. ex Benth.）Huang與臭辣吳萸Euodia fargesiiDode為蕓香科吳茱萸屬Euodia植物，兩者在藥用存在明顯的不同[1-2]。臭辣吳萸果實(shí)在廣西和湖北是吳茱萸的地方習(xí)用品，但研究[3-4]表明臭辣吳萸藥材品質(zhì)略低于吳茱萸，而楝葉吳萸的果實(shí)則是吳茱萸藥材的常見偽品。Flora of China[5]將楝葉吳萸Euodia glabrifolia（Champ. ex Benth.）Huang與臭辣吳萸Euodia fargesiiDode合并為Tetradium glabrifolium（Champion ex Bentham）T. G. Hartley。可見，植物分類與藥用情況存在差異。上述現(xiàn)象的主要原因是吳茱萸屬植物形態(tài)極其相似，同種形態(tài)變化較大，根據(jù)其外觀形態(tài)很難準(zhǔn)確區(qū)分。且現(xiàn)代分子鑒定方面研究使用的通用DNA條形碼（ITS2和psbA-trnH）對(duì)吳茱萸屬植物鑒別也不理想[6-7]。因此，亟待闡明吳茱萸屬藥用植物的種間親緣關(guān)系并尋找更適合吳茱萸屬藥用植物種質(zhì)資源鑒定的方法。

植物的葉綠體基因組以其單親本遺傳、序列長(zhǎng)度適中和進(jìn)化速度較慢等特征[8-9]，不僅成功應(yīng)用在諸多鑒定困難的藥用植物中，同時(shí)在確定系統(tǒng)發(fā)育位置、近緣物種間的親緣關(guān)系和揭示物種起源等方面作出了重要貢獻(xiàn)，例如中藥材赤芍、大黃的基原鑒定和川貝母及其近緣種親緣關(guān)系的確定[10-12]。近年來，已有部分吳茱萸屬物種完成了葉綠體基因組測(cè)序，如吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpavar.officinalis(Dode) Huang等物種，但是關(guān)于楝葉吳萸和臭辣吳萸的葉綠體基因組測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析的研究還未見報(bào)道。因此，本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)楝葉吳萸和臭辣吳萸的葉綠體基因組序列進(jìn)行了測(cè)序、組裝和分析，并與吳茱萸藥材正品基原吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpavar.officinalis（Dode） Huang葉綠體基因組比較，篩選出種間高變異位點(diǎn)，以期為確定楝葉吳萸Euodia glabrifolia（Champ. ex Benth.）Huang與臭辣吳萸Euodia fargesiiDode分類學(xué)地位提供分子生物學(xué)證據(jù)，并且為吳茱萸藥材分子鑒定提供參考。

1 材料、儀器與軟件

1.1 材料 本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料為楝葉吳萸和臭辣吳萸的健康新鮮嫩葉，分別采自廣州市、長(zhǎng)沙市與黃山市，并經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院劉浩副研究員鑒定。楝葉吳萸與臭辣吳萸樣品各兩份，對(duì)應(yīng)憑證標(biāo)本保存于湖南省中醫(yī)藥研究院藥用植物標(biāo)本館（HUTM）。所測(cè)葉綠體基因組數(shù)據(jù)已上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為OP974489，OP974490[楝葉吳萸Euodia glabrifolia（Champ. ex Benth.）Huang]和OP974487，OP974488（臭辣吳萸Euodia fargesiiDode）。用于比較分析的葉綠體基因組均從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載，分別為吳茱萸[Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth.，NC_052830][13]和石虎（Euodia rutaecarpavar.officinalis(Dode) Huang，MT134114）[14]。

1.2 儀器與軟件

1.2.1 儀器 賽默飛75002440高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；JXFSTPRP-CL冷凍研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；伯樂T100 PCR儀（伯樂生物科技有限公司）；天能HE-120凝膠電泳儀（上海天能科技有限公司）；Nano-300微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）；Covaris DNA打斷儀器（Covaris, USA）；NEBNextUltraTMⅡDNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA)；Qubit3.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA)；Agilent Bioanalyzer 2100 system (Agilent Technologies, CA, USA)；NovaSeq 6000 (Illumina, USA)

1.2.2 軟件 SOAPnuke (v.1.3.0)；SPAdes (v.3.15)；Bandage；MPI-MP CHLOROBOX；condonW (v.1.4.2)；MAFFT (v.7.490)；REPuter；Tandem Repeats Finder；Misa.pl；mVISTA；IRscope；DnaSP (v.6.12.03)；IQ-TREE 2；Chiplot Online。

2 方法

2.1 基因組DNA提取與測(cè)序 取新鮮健康嫩葉，使用CTAB法提取總基因組DNA[15]。DNA經(jīng)檢測(cè)合格后，用Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成350 bp左右大小片段，使用NEB NextUltraTMⅡDNA for Illumina文庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒構(gòu)建用于測(cè)序的150 bp雙末端測(cè)序文庫(kù)。建好的文庫(kù)先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，插入片段大小符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，質(zhì)量檢測(cè)合格的文庫(kù)在Illumina NovaSeq 6000（北京擎科生物科技有限公司）平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，下機(jī)后采用SOAPnuke v.1.3.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得的高質(zhì)量序列（clean reads）以FASTQ格式保存[16]。

2.2 葉綠體基因組的組裝與注釋 過濾后的數(shù)據(jù)使用SPAdes v.3.15軟件[17]進(jìn)行葉綠體基因組從頭組裝，組裝參數(shù)k-mer大小為55 105 127。組裝的contigs序列文件，使用Bandage軟件[18]除去冗余序列，并以吳茱萸葉綠體基因組（Gen－Bank登錄號(hào)NC_052830）為參考，手動(dòng)校正每個(gè)contig的方向與位置，最終獲得一條環(huán)狀的葉綠體基因組序列。使用MPIMP CHLOROBOX（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/index.html）在線注釋程序?qū)ν瓿山M裝的葉綠體基因組序列進(jìn)行注釋[19]，以NC_052830注釋信息為參考，必要時(shí)手動(dòng)糾正密碼子的起始和終止邊界。葉綠體基因組可視化圈圖利用OGDRAW在線程序繪制[20]。

2.3 密碼子偏好性分析與重復(fù)序列檢測(cè) 使用condonW v.1.4.2軟件[21]對(duì)4種吳茱萸屬植物的葉綠體基因組密碼子偏好性進(jìn)行分析，包括GC含量、密碼子使用頻率和相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）。在分析之前需對(duì)蛋白編碼基因進(jìn)行處理：（1）去除非ATG開頭的蛋白編碼基因；（2）刪除重復(fù)的蛋白編碼基因；（3）刪除小于300 bp的蛋白編碼基因。最后將獲得的52條蛋白編碼基因拼接成一條，所有序列保存在一個(gè)文件中，并使用MAFFT v.7.490軟件[22]進(jìn)行多序列比對(duì)。

REPuter與Tandem Repeats Finder在線程序[23-24]被用于葉綠體基因組的長(zhǎng)重復(fù)序列分析，包括正向重復(fù)（Forward repeats，F(xiàn)）、反向重復(fù)（Reverse repeats，R）、回文重復(fù)（Palindromic repeats，P）和串聯(lián)重復(fù)（Tandem repeats，T）；參數(shù)：海明距離（Hamming distance）為3，最小重復(fù)片段大小（minimal repeat size）為30 bp，最大計(jì)算重復(fù)次數(shù)（maximum computed repeats）為5 000 bp。Misa.pl腳本[25]被用于識(shí)別葉綠體基因組的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSRs），使用以下參數(shù)設(shè)置：最小重復(fù)數(shù)單核苷酸為10 bp，二核苷酸為5 bp，三核苷酸為4 bp，四、五和六核苷酸為3 bp，兩個(gè)SSRs之間最小間距為-6 bp。

2.4 葉綠體基因組比較分析 利用mVISTA（Shuffle-LAGAN模式）軟件[26]以吳茱萸葉綠體基因組為參照，將新測(cè)葉綠體基因組與吳茱萸和石虎（NC_052830和MT134114）葉綠體基因組進(jìn)行全局比對(duì)分析；使用IRscope在線程序[27]繪制上述6個(gè)葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)（IR）邊界圖，并根據(jù)邊界上的基因位置差異分析其收縮與擴(kuò)張情況；使用DnaSP v.6.12.03軟件[28]分析4種吳茱萸屬藥用植物的序列多態(tài)性，根據(jù)核苷酸多樣性值（Pi）與mVISTA結(jié)果篩選高變異區(qū)，滑動(dòng)窗口長(zhǎng)度設(shè)置為600 bp，步長(zhǎng)設(shè)置為200 bp。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 為明確4種吳茱萸屬藥用植物的種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育位置。本研究選擇以臭辣吳萸和楝葉吳萸在內(nèi)的31條葉綠體基因組的共有蛋白編碼基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，鴉膽子Brucea javanica (L.) Merr.（NC_063730）為外類群。建樹前利用MAFFT v.7.490軟件進(jìn)行多重比對(duì)，完成比對(duì)的序列使用IQ-TREE軟件包[29]中的ModelFinder確定最佳模型，并在IQ-TREE軟件中基于最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置自展值（Bootstrap value）為1 000；最佳擬合模型為GTR+F+R2。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果使用Chiplot Online（https://www.chiplot.online/tvbot.html）在線程序查看。

3 結(jié)果與分析

3.1 吳茱萸屬葉綠體基因組特征 4種吳茱萸屬植物的葉綠體基因組均為典型的四分體結(jié)構(gòu)，包括一對(duì)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeats，IRs）分別被一個(gè)大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）和一個(gè)小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）分開。（見圖1）葉綠體基因組大小為158 563（E. glabrifolia）～158 762 bp（E.rutaecarpa），LSC區(qū)大小為86 104（E. glabrifolia）～86 299 bp（E.rutaecarpa var. officinalis），SSC區(qū)大小為18 212（E. fargesii）～18 265 bp（E. rutaecarpa var. officinalis），IR區(qū)大小為27 101（E. rutaecarpa var. officinalis）～27 127 bp（E. fargesii）?；蚪M的GC含量是判斷物種親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，吳茱萸屬葉綠體基因組總GC含量為38.34%～38.37%，LSC、SSC、IR區(qū)的GC含量相似（見表1），可見吳茱萸屬植物葉綠體基因組大小和GC含量存在一定差異，但差異不明顯。

表1 葉綠體基因組特征統(tǒng)計(jì)

圖1 楝葉吳萸與臭辣吳萸葉綠體基因組圈圖

葉綠體基因組注釋結(jié)果表明，楝葉吳萸與臭辣吳萸葉綠體基因組在基因大小、位置與數(shù)量上高度一致，均檢測(cè)到134個(gè)基因，包括蛋白質(zhì)編碼基因（PCGs）89個(gè)，tRNA基因37個(gè)，rRNA基因8個(gè)。共有19個(gè)編碼基因在IR區(qū)重復(fù)，包括4個(gè)rRNA、7個(gè)tRNA、8個(gè)PCGs。在這兩個(gè)物種的葉綠體基因組中，均檢測(cè)到18個(gè)基因含有內(nèi)含子，其中3個(gè)基因（rps12、ycf3和clpP）含有2個(gè)內(nèi)含子，其余15個(gè)基因（petB、petD、atpF、ndhA、ndhB、rpoC1、rps16、rpl2、rpl16、trnA、trnG、trnI、trnK、trnL和trnV）含有1個(gè)內(nèi)含子。（見表2）

表2 吳茱萸屬葉綠體基因組基因構(gòu)成

3.2 密碼子使用偏性分析 在4種吳茱萸屬植物的葉綠體蛋白編碼基因中共發(fā)現(xiàn)64種密碼子（見圖2）。密碼子使用偏性分析發(fā)現(xiàn)，編碼楝葉吳萸與臭辣吳萸的葉綠體基因組密碼子均為20 845個(gè)，比石虎（20 836個(gè)）和吳茱萸（20 831個(gè)）稍多。在這些密碼子編碼的氨基酸中，亮氨酸（Leu）的使用頻率最高，而半胱氨酸（Cys）最低。編碼亮氨酸的UUA密碼子和編碼酪氨酸的UAC密碼子的RSCU值分別為最高和最低。共有30個(gè)密碼子的RSCU值大于1，其中29個(gè)是A/U結(jié)尾的密碼子，表明這些同義密碼子使用頻率較高；共有32個(gè)密碼子的RSCU值小于1，其中28個(gè)是G/C結(jié)尾的密碼子，表明這些同義密碼子使用頻率較低。編碼蛋氨酸（AUG）和色氨酸（UGG）的密碼子只有1個(gè)，而且RSCU值為1，表明這些同義密碼子沒有偏好性。使用頻率高的密碼子幾乎都以A/U結(jié)尾，表明4種吳茱萸屬植物均偏好使用A/U結(jié)尾密碼子。終止密碼子的使用偏向于UAA密碼子，臭辣吳萸與其他物種相比主要在終止密碼子偏好上表現(xiàn)出差異，終止密碼子UAA的偏好性略低。

圖2 4 種吳茱萸屬植物的RSCU 值熱圖

3.3 長(zhǎng)重復(fù)序列與簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）分析 從4個(gè)吳茱萸屬植物葉綠體基因組中共鑒定出149個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列（30～90 bp）（見圖3）。其中正向重復(fù)序列67個(gè)，回文重復(fù)序列59個(gè)，反向重復(fù)序列21個(gè)，互補(bǔ)重復(fù)序列2個(gè)。在吳茱萸中檢測(cè)到41個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，石虎中檢測(cè)到37個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，楝葉吳萸中檢測(cè)到35個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，臭辣吳萸中檢測(cè)到36個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列。此外，還檢測(cè)到串聯(lián)重復(fù)序列141個(gè)（9～90 bp）。4個(gè)物種的長(zhǎng)重復(fù)序列在類型上相近，但是在數(shù)量上有差異。臭辣吳萸相較于其余物種在串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)量上的差異尤為突出。

圖3 長(zhǎng)重復(fù)序列鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

利用Misa.pl腳本從4種吳茱萸屬植物的葉綠體基因組中共鑒定出350個(gè)SSR，在吳茱萸植物中共檢測(cè)到98個(gè)SSR，石虎植物中共檢測(cè)到91個(gè)SSR，楝葉吳萸植物中共檢測(cè)到79個(gè)SSR，臭辣吳萸植物中共檢測(cè)到82個(gè)SSR。共檢出5種類型核苷酸重復(fù)序列，分別為單核苷酸（mononucleotide）、二核苷酸（dinucleotide）、三核苷酸（trinucleotide）、四核苷酸（tetranucleotide）和五核苷酸（pentanucleotide）重復(fù)序列，沒有檢測(cè)到六核苷酸（hexanucleotide）重復(fù)序列（見圖4）。以單核苷酸重復(fù)序列最多（59～78個(gè)），占SSR總數(shù)的74%～80%，其次為三或四核苷酸SSR，五核苷酸SSR最少。在所有核苷酸重復(fù)序列中以A/T重復(fù)序列最多。此外，就分布位置而言，這些位點(diǎn)在葉綠體基因組中分布是不均勻的，76% SSR位點(diǎn)分布于LSC區(qū)，11% SSR分布于SSC區(qū)，13% SSR分布于IRs區(qū)。

圖4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

3.4 葉綠體基因組比較與序列多樣性分析 為了明確6個(gè)吳茱萸屬葉綠體基因組序列之間的差異程度，使用mVISTA對(duì)序列進(jìn)行了比對(duì)（見圖5）。結(jié)果表明，6個(gè)序列之間的分化程度較低，具有高度的相似性。其中IR區(qū)變異程度比SC區(qū)低，非編碼區(qū)變異程度明顯比編碼區(qū)的高。存在較高差異的序列為trnS-trnG、atpF-atpH、psbZ-trnG、ycf4-cemA、rpl22和ycf1-ndhF。使用DNAsp軟件分析了4種吳茱萸屬植物的葉綠體基因組核苷酸多樣性（Pi）（見圖6），結(jié)果共檢測(cè)到298個(gè)多態(tài)性（分離）位點(diǎn)，Pi值變化范圍為0～0.01，平均Pi值為0.001 06。此外，通過Pi值的比較篩選了5個(gè)多樣性較高的點(diǎn)，分別是psbM-trnA、psbCtrnS、ycf4-cemA、clpP和rpl32-trnL，它們的核苷酸多態(tài)性均大于0.008。其中4個(gè)位點(diǎn)位于LSC區(qū)，1個(gè)位于SSC區(qū)，基因間隔區(qū)psbM-trnA的核苷酸多態(tài)性最高。這些位點(diǎn)的篩選對(duì)于吳茱萸屬植物分子標(biāo)記的開發(fā)具有潛在價(jià)值。

圖5 6 個(gè)吳茱萸屬植物的葉綠體基因組序列比對(duì)圖

圖6 滑動(dòng)窗口分析圖

將4個(gè)吳茱萸屬物種的葉綠體基因組的IR區(qū)邊界進(jìn)行比較分析（見圖7），結(jié)果表明這些葉綠體基因組高度保守，但也存在一定差異。LSC/IRb（JLB）、IRb/SSC（JSB）、SSC/IRa（JSA）邊界分別位于rpl22、ycf1假基因與ycf1基因之中，IRa/LSC（JLA）邊界則位于rpl22與trnH基因之間。其中rpl22基因跨越JLB邊界至IRb區(qū)246～260 bp，ycf1假基因跨越JSB邊界至IRb區(qū)1183～1196bp，ycf1基因跨越JSA邊界至IRa區(qū)1 183～1 196 bp，rpl22基因距離JLA邊界1 bp。吳茱萸與石虎的邊界跨越結(jié)果較為一致，但rpl22基因跨越距離有差異。

圖7 吳茱萸屬6 個(gè)植物葉綠體基因組IR 邊界比較分析

3.5 親緣關(guān)系研究 為了明確4種吳茱萸屬植物之間的親緣關(guān)系，本研究采用最大似然法（ML）研究了蕓香科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中包括30個(gè)蕓香科植物和1個(gè)苦木科植物的葉綠體基因組（見圖8）。結(jié)果顯示以共有蛋白編碼基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有較高的支持度，同屬物種均聚集在同一分支中。在整個(gè)蕓香科植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上，與吳茱萸屬植物親緣關(guān)系最近的屬是黃檗屬植物。在吳茱萸屬內(nèi)，吳茱萸與石虎以100%的支持度聚為一支，楝葉吳萸與臭辣吳萸以75%的支持度聚為一支，且這兩支互為姐妹關(guān)系。蜜楝吳萸早于其余兩支吳茱萸屬物種分化出來并且遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖8 基于葉綠體基因組共有蛋白編碼基因構(gòu)建的最大似然（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

本研究完成了藥用植物楝葉吳萸與臭辣吳萸葉綠體基因組的測(cè)序、組裝與注釋，并進(jìn)行了比較分析?；蚪M特征分析結(jié)果表明吳茱萸屬的葉綠體基因組在進(jìn)化過程中高度保守。密碼子使用偏好性是葉綠體基因組中一個(gè)重要進(jìn)化特征，能在一定程度上反映物種的親緣關(guān)系[30-31]。從RSCU值熱圖可看出4種吳茱萸屬植物的親緣關(guān)系很近，且以吳茱萸與石虎最近。此外，吳茱萸屬植物密碼子的堿基使用偏好A/U，這與其他蕓香科植物的密碼子使用偏性結(jié)果一致[32]。

重復(fù)序列的檢測(cè)對(duì)植物的遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源的分子標(biāo)記鑒定具有重要意義。與其他被子植物研究結(jié)果一致，SSR位點(diǎn)在葉綠體基因組中分布是不均勻的，大部分位于LSC區(qū)，A/T單核苷酸重復(fù)類型最為常見[33]。吳茱萸屬4個(gè)物種的長(zhǎng)重復(fù)序列在類型上相近，但是在數(shù)量上有差異，例如長(zhǎng)重復(fù)序列的主要組成類型正向重復(fù)與回文重復(fù)序列，吳茱萸與石虎的數(shù)量相近，楝葉吳萸與臭辣吳萸的數(shù)量相近。臭辣吳萸與其余物種的差異主要體現(xiàn)在串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)量的差異。這表明4種吳茱萸屬植物的突變頻率存在一定差異。

通過分析，本研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸屬的葉綠體基因組IR區(qū)較LSC區(qū)和SSC區(qū)更為保守，且基因間區(qū)的多樣性明顯高于基因編碼區(qū)。篩選出的高變區(qū)與通用DNA條形碼（psbA-trnH、rbcL、matK等）相比表現(xiàn)出更高的變異性，因此可作為鑒別吳茱萸及其混偽品的潛在分子標(biāo)記，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。吳茱萸屬物種的IR區(qū)邊界存在差異，種間差異主要表現(xiàn)在JLB與JSA邊界，在葉綠體基因組進(jìn)化中起重要作用的rpl22與ycf1表現(xiàn)出較高的差異。

基于共有蛋白編碼基因構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。吳茱萸與石虎為姊妹類群，支持率為100%，表明兩者親緣關(guān)系最近；楝葉吳萸與臭辣吳萸為姊妹類群，支持率為75%，親緣關(guān)系較近。臭辣吳萸和楝葉吳萸在吳茱萸屬分支中最先分化出來，且與其余吳茱萸屬物種親緣都較遠(yuǎn)。之前的研究顯示對(duì)于蛋白編碼基因鑒定效果不理想的物種，可以利用葉綠體全基因組作為超級(jí)條形碼有效鑒定分類困難物種[34]，這有助于重建高分辨率的吳茱萸屬系統(tǒng)發(fā)育樹。

本研究首次報(bào)道了蕓香科藥用植物楝葉吳萸與臭辣吳萸的葉綠體全基因組，明確了4種吳茱萸屬植物的葉綠體基因組特征，篩選了一批用于吳茱萸藥材真?zhèn)舞b定的DNA條形碼潛在位點(diǎn)，闡明了蕓香科植物種屬之間的親緣關(guān)系，為我國(guó)吳茱萸藥材正品和混偽品基原物種的分子鑒定研究提供了科學(xué)依據(jù)，也為蕓香科植物的分類、育種和遺傳多樣性研究提供了亟需的分子遺傳信息。