趙 元，黃晨存，黃詩怡，袁志鷹，許光明

（湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

玄參為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，且為藥食兩用的藥材。環(huán)烯醚萜類和苯丙素苷類是玄參屬植物的主要化學成分，藥理研究表明其具有降血壓、抗血小板聚集、增強免疫功能、降血糖、抗氧化和抗腫瘤等作用[1]。2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定玄參主要成分為哈巴苷、哈巴俄苷[2]。玄參目前的藥用部位是其塊根部分。玄參種芽為玄參生長的地下根芽，現(xiàn)作為繁育或栽培用的繁殖組織。玄參種芽的產量大，但用于繁育的量不多，造成了大量玄參種芽的資源浪費[3-4]。前期研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，玄參種芽中的化學成分與市面流通的玄參藥材的藥用化學成分高度相似，故可從化學成分入手，對玄參種芽進行相關研究，開發(fā)玄參種芽資源。目前，市面上玄參中哈巴苷等有效成分的提取主要使用傳統(tǒng)的熱水煎煮法或回流提取[9-10]，該方法耗時長、需高溫處理且提取效率低，且哈巴俄苷具有熱不穩(wěn)定性[11-12]。因此，筆者擬采用超聲輔助提取玄參種芽的有效成分，參考文獻[13-14]選擇不同料液比、浸泡時間和提取液濃度采用單因素試驗結合響應面分析法優(yōu)化玄參種芽提取工藝，通過HPLC法測定其含量[15-16]，得出玄參種芽最佳提取工藝，從而提高玄參種芽的提取效率，為后續(xù)玄參種芽研究提供理論依據與基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（瑞典Nouryon公司）；ISO9001型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；040SD型超聲波清洗機（深圳市超潔科技實業(yè)有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（上海申生科技有限公司）；WGL-125B型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 玄參種芽采自湖南新邵常春藤種植基地，經湖南中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）；哈巴苷對照品（批號：DST220312-058，純度≥98%）、哈巴俄苷對照品（批號：DST220113-059，純度≥98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）均購于美國TEDIA公司；實驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 哈巴苷、哈巴俄苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液（B）-乙腈（A），梯度洗脫，洗脫程序為0～5 min，5%A～20%A；5～10 min，20%A～25%A；10～20 min，25%A～33%A；20～25 min，33%A～50%A；25～30 min，50%A～80%A；30～35 min，80%A；35～40 min，80%A～95%A；40 ～50 min，95%A～5%A；體積流量為1 mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 圖

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱定哈巴苷對照品、哈巴俄苷對照品適量，加入甲醇配制成哈巴苷、哈巴俄苷質量濃度分別為0.500、0.340 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 玄參種芽采收后洗凈表面泥沙，進行發(fā)汗處理，將處理過后的玄參種芽粉碎成粉，精密稱取1.000 0 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度甲醇，密塞，稱定質量，浸泡一定時間，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 線性關系考察 取“2.1.2.1”項下的混合對照品溶液用甲醇稀釋至不同濃度梯度，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，取20 μL，按照“2.1.1”項色譜條件進樣分析，以濃度為橫坐標（x），對應的高效液相色譜峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。結果哈巴苷、哈巴俄苷的回歸方程分別為y=5 354 876x+37 356（r=0.999 6）、y=29 309 518x+2 563（r=0.999 6）。表明哈巴苷、哈巴俄苷分別在15.63～500.00 μg/mL、10.63～340.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定各對照品峰面積。結果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.80%、1.98%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、16、24 h按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，測定各對照品峰面積。結果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為1.27%、1.87%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液，每次進樣20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，測定各對照品峰面積。結果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積RSD分別為1.05%、1.49%，表明方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 分別取6份同一批已知含量樣品0.500 0 g，加入混合對照品溶液，按“2.1.2.2”項下方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果哈巴苷、哈巴俄苷平均回收率分別為100.24%、100.56%，RSD分別為1.98%、1.19%，表明方法準確度良好。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結果 （n=6）

2.2 單因素試驗 固定料液比為1∶50（g/mL），浸泡時間為30 min，考察不同甲醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）對玄參種芽提取的影響，篩選出最佳甲醇濃度；然后將其作為最佳條件固定，再分別考察料液比[1∶25、1∶50、1∶75、1∶100、1∶125（g/mL）]、浸泡時間（10、20、30、40、50 min）對玄參種芽提取的影響。每次改變1個因素，考察完1個因素后，將其最佳條件作為下1個因素的固定條件，直至完成全部單因素試驗。

2.2.1 甲醇濃度對提取的影響 經不同濃度甲醇提取后，哈巴苷、哈巴俄苷的含量隨甲醇濃度的升高均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，且分別在40%甲醇、60%甲醇時達到最高值；哈巴苷與哈巴俄苷總含量隨甲醇濃度的升高也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，并在40%甲醇時達到最高值。故選擇35%、40%、45%甲醇進行響應面試驗。（見圖2A）

圖2 甲醇濃度（A）、料液比（B）及浸泡時間（C）對提取的影響圖

2.2.2 料液比對提取的影響 經不同體積甲醇提取后，哈巴苷、哈巴俄苷的含量分別在料液比1∶25、1∶50時達到最高值；哈巴苷與哈巴俄苷總含量隨料液比的升高呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢，即1∶50＞1∶25＞1∶125＞1∶100＞1∶75，故選擇1∶40、1∶50、1∶60料液比（g/mL）進行響應面試驗。（見圖2B）

2.2.3 浸泡時間對提取的影響 經不同時間浸泡提取后，哈巴苷、哈巴俄苷的含量分別在20 min、30 min達到最高值；哈巴苷與哈巴俄苷總含量隨料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，即30 min＞20 min＞10 min＞40 min＞50 min，故選擇浸泡時間25、30、35 min進行響應面試驗。（見圖2C）

2.3 Box-Behnken響應面試驗

2.3.1 響應面設計 根據響應面試驗設計（Box-Behnken design，BBD）原理，在單因素試驗基礎上，利用Design Expert 10設計實驗，以料液比（A）、甲醇濃度（B）、浸泡時間（C）作為自變量，以哈巴苷、哈巴俄苷總含量為考察指標，建立3因素3水平共17個實驗組合響應面分析試驗數學模型對玄參種芽超聲提取工藝進行優(yōu)化[18]。設計因素與水平見表2，Box-Behnken結果見表3。

表2 Box-Behnken 設計因素水平

表3 Box-Behnken 響應面設計及結果

2.3.2 模型擬合及分析 運用Design Expert軟件對以上結果進行方差分析，得回歸方程：Y=1.72+0.069A+0.071B-0.063C+0.22AB-0.061AC+0.14BC-0.11A2-0.20B2+0.029C2，r=0.983 8。模型的方差分析結果見表4。線性模型F=23.53，P=0.000 2，表明該回歸方程差異性顯著。失擬項P=0.582 8，說明該實驗設計數據可靠。方差分析結果表明，在所選的各因素水平范圍內，按照對哈巴苷、哈巴俄苷總含量影響大小排序為A＞C＞B，除C2外，均達到顯著水平，其中甲醇濃度和浸泡時間為極顯著。

表4 模型方差分析

2.3.3 響應面優(yōu)化結果 通過Design Expert 12.0軟件繪制各指標與響應值交互項的響應面圖，可直觀評價各因素對玄參種芽中哈巴苷、哈巴俄苷總含量的影響。結果顯示隨著各因素的增加哈巴苷、哈巴俄苷總含量均呈現(xiàn)先增加后逐漸減少的趨勢。甲醇濃度和浸泡時間的曲面較陡峭，提示甲醇濃度和浸泡時間對哈巴苷、哈巴俄苷總含量影響較明顯。這與二次回歸模型中的方差分析結果一致。（見圖3～5）

圖4 甲醇濃度與浸泡時間的交互作用響應面圖

圖5 料液比與浸泡時間的交互作用響應面圖

2.3.4 驗證試驗 通過響應面模型分析，預測最優(yōu)玄參種芽提取工藝為甲醇濃度44.34%、料液比1∶51、浸泡時間25.41 min，哈巴苷、哈巴俄苷總含量為1.84%。

為檢驗以上響應面分析數據的可靠性，同時為了操作方便，本研究參數采用甲醇濃度44%、料液比1:50、浸泡時間25 min，進行3組平行試驗。結果實際測得哈巴苷、哈巴俄苷總含量分別為1.81%、1.86%、1.78%，RSD均小于2%。提示應用響應面分析法優(yōu)化得到的玄參種芽最佳提取條件準確、可靠，提取工藝具有良好的可行性及重復性。

3 討論

玄參具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結之效，并在四妙勇安湯、增液承氣湯、清營湯等多個方劑中有重要應用。玄參種芽產量高，僅用于繁育，資源浪費嚴重，極具開發(fā)價值。本課題組在玄參種芽與玄參化學成分研究的基礎上，對玄參種芽提取工藝進行研究。

單因素試驗可以看出：哈巴苷、哈巴俄苷總含量在甲醇濃度40%時達到最大值。環(huán)烯醚萜類成分在40%的甲醇溶液中的溶解性最好。當料液比較小時，玄參種芽提取不完全，這在一定程度上降低了哈巴苷、哈巴俄苷的含量；而料液比過大時，由于傳質阻力，過量的溶劑不再起到提取的作用，反而會降低哈巴苷、哈巴俄苷的含量。隨著浸泡時間的延長，哈巴苷、哈巴俄苷總含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；當浸泡30 min時，超聲提取所得的哈巴苷、哈巴俄苷總含量最高；隨著浸泡時間的延長，哈巴苷、哈巴俄苷總含量下降，如浸泡50 min后哈巴苷、哈巴俄苷總含量為最高總含量的90%左右。這可能是由于浸泡時間過短，玄參種芽粉末不能很好地分散，甚至聚集在溶劑中，因接觸面積的減少而影響了哈巴苷、哈巴俄苷的含量；浸泡時間過長會使玄參粉末中的糖類、蛋白質等擴散出來，形成膠團依附于粉末表面，阻礙了環(huán)烯醚萜類的溶出，導致哈巴苷、哈巴俄苷含量降低。

本研究以玄參種芽為研究對象，以2020年版《中華人民共和國藥典》[2]規(guī)定玄參主要成分哈巴苷、哈巴俄苷含量為指標，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken設計試驗方案[18-19]研究3個影響因素間的交互作用，再進行回歸分析[20-21]，從而得到影響因素的最佳組合與響應值的最優(yōu)值[22-23]。玄參種芽哈巴苷、哈巴俄苷最佳提取工藝為甲醇濃度44%、料液比1∶51、浸泡25 min。該工藝穩(wěn)定可靠，有助于玄參種芽的提取，從中獲取哈巴苷、哈巴俄苷等有效成分，可為玄參種芽資源開發(fā)提供理論依據[24-25]。