趙新然，王玉娜，曾 倩

（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000）

宮頸癌是全球女性第三大惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。宮頸癌主要由持續(xù)性人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起，是一種高度可預(yù)防的疾病。雖然有效篩查和接種疫苗可以預(yù)防最具致癌性的HPV毒株，使宮頸癌的發(fā)病率和病死率有所下降[1-2]，但中晚期患者容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。目前，臨床上治療宮頸癌仍以手術(shù)為主，并結(jié)合放療、化療，但術(shù)后創(chuàng)傷和不良反應(yīng)較重，影響患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[3]。中藥含有的諸多化學(xué)成分已被提取并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，顯示出了較好的療效。木犀草素在自然界分布廣泛，主要來源是全葉青蘭、白毛夏枯草、野菊花、金銀花和紫蘇等植物，是一種天然黃酮類活性物質(zhì)，可以作為一種抗氧化劑及抗癌劑治療多種疾病，如原發(fā)性高血壓、炎癥性疾病和癌癥[4]。木犀草素在治療腫瘤方面具有良好的前景，可以預(yù)防和治療肺癌[5]、肝癌[6]、乳腺癌[7]和前列腺癌[8]等多種癌癥。作為細(xì)胞因子重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路[9]對(duì)多種腫瘤細(xì)胞[10-11]的增殖和凋亡有著重要的影響，該信號(hào)通路的持續(xù)激活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。已有研究表明木犀草素能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)影響人舌鱗癌細(xì)胞的增殖與凋亡[12]。然而，目前木犀草素對(duì)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與宮頸癌的作用尚不清楚。本研究對(duì)木犀草素作用宮頸癌細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討，以期為木犀草素開發(fā)成治療腫瘤的新藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人子宮頸腺癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞系（編號(hào)：BNCC 342189，批號(hào)：21122303），購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

1.2 藥物與試劑 木犀草素（批號(hào)：S08GS160295）、BAY 11-7082（NF-κB信號(hào)通路抑制劑，批號(hào)：J07HS173399）均購自上海源葉生物科技有限公司；引物序列由北京華大基因設(shè)計(jì)合成；胎牛血清（FBS）（批號(hào)：2176404）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：B20220221）均購自美國Gibco公司；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號(hào)：042621211123）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33258染色試劑盒（批號(hào)：20220304）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；結(jié)晶紫（批號(hào)：20220318）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：H2107011）、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（批號(hào)：H4001330）均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；RIPA裂解液（批號(hào)：051322220531）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）（批號(hào)：221N053）購自美國Gibco公司；鼠抗人NF-κB抗體（批號(hào)：10021394）、p-NF-κB抗體（批號(hào)：10021523）、細(xì)胞周期素D1抗體（Cyclin D1）（批號(hào)：10016419）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（批號(hào)：10021291）和β-actin（批號(hào)：10021787）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗）（批號(hào)：20000374）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 BC-J160型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（美國ABI公司）；OI-1000型凝膠成像系統(tǒng)（廣州光儀生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，將HeLa細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）中，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞處理及分組 將HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組、5 μmol/L木犀草素組、10 μmol/L木犀草素組、20 μmol/L木犀草素組，對(duì)照組HeLa細(xì)胞不做處理，5、10、20 μmol/L木犀草素組HeLa細(xì)胞分別以5、10和20 μmol/L木犀草素處理24 h，經(jīng)過細(xì)胞功能（增殖、克隆、凋亡）及Cyclin D1、Caspase-3（增殖和凋亡標(biāo)志物）蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)篩選出10 μmol/L木犀草素進(jìn)行后續(xù)通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，然后將細(xì)胞分為對(duì)照組、10 μmol/L木犀草素組和抑制劑組，其中抑制劑組用10 μmol/L木犀草素＋2.5 μmol/L BAY 11-7082處理24 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 EdU法測定HeLa細(xì)胞的增殖 將HeLa細(xì)胞接種到24孔板中，每孔加約1×105個(gè)細(xì)胞，取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞，進(jìn)行EdU處理，去除培養(yǎng)液，用0.5 mL 4%多聚甲醛固定，室溫15 min，用0.5 mL 3%BSA洗滌3次；用0.5 mL 0.3%TritonX-100去除BSA，室溫10 min，再用BSA洗滌3次；12孔板中每孔加200 μL Click反應(yīng)液（現(xiàn)配現(xiàn)用），室溫避光孵育30 min，3% BSA洗滌3次去除Click反應(yīng)液；每孔加入0.5 mL Hoechst，室溫避光孵育10 min；再用3% BSA洗滌3次去除Hoechst；裝片，倒置熒光顯微鏡拍照，再用ImageJ軟件處理圖片。EdU陽性染色細(xì)胞（紅色）占總細(xì)胞（藍(lán)色）的百分比表示細(xì)胞增殖率。

2.3.2 平板克隆形成法測定HeLa細(xì)胞的克隆形成率 將1.2×103個(gè)/孔HeLa細(xì)胞接種于6孔板，觀察細(xì)胞克隆形成情況。培養(yǎng)2周后用甲醇固定15min，再用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS清洗多余的染料，風(fēng)干后拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。細(xì)胞克隆形成率（%）=細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.3.3 Hoechst 33258染色法測定HeLa細(xì)胞的凋亡情況 將HeLa細(xì)胞接種到24孔板中，每孔加約1×105個(gè)細(xì)胞，干預(yù)24 h后，細(xì)胞用4%多聚甲醛（現(xiàn)用現(xiàn)配）于4 ℃固定細(xì)胞10 min，然后用5 mg/L的Hoechst 33258染色液染色10 min，封固后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，并隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照。

2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測HeLa細(xì)胞中Cyclin D1mRNA和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲取cDNA模版。然后參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。條件為：預(yù)變性5min（95℃）；變性35 s（95 ℃），退火35 s（60 ℃），延伸35 s（72 ℃），設(shè)置40次循環(huán)。GAPDH作內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列

2.3.5 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測HeLa細(xì)胞Caspase-3、Cyclin D1、NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量 藥物干預(yù)24h后，各組細(xì)胞在冰上裂解于RIPA液，4 ℃，1 2000 r/min（離心半徑為8 cm）離心20 min，取上清蛋白，變性，制膠，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜（200 mA恒流），封閉2 h（5%脫脂牛奶）后，加入一抗（NF-κB、p-NF-κB、Cyclin D1、Caspase-3和β-actin）4 ℃孵育過夜，然后加入標(biāo)記的二抗孵育2 h，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G表示，蛋白相對(duì)表達(dá)量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白（β-actin）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度木犀草素抑制HeLa細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 不同濃度木犀草素處理HeLa細(xì)胞24 h后，EdU陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，作用HeLa細(xì)胞2周后，細(xì)胞克隆形成數(shù)逐漸減少。鏡下圖顯示細(xì)胞形成的克隆集落，反映了細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞依賴性；ImageJ軟件定量結(jié)果顯示，5 μmol/L木犀草素組細(xì)胞增殖率和克隆形成率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），10、20 μmol/L木犀草素組細(xì)胞增殖率和克隆形成率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，不同濃度木犀草素增加了HeLa細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞核呈亮藍(lán)色），且濃度越高凋亡細(xì)胞數(shù)越多。（見圖1～4）

圖1 各組HeLa 細(xì)胞EdU 染色圖 （×20）

圖2 各組HeLa 細(xì)胞平板克隆圖 （×20）

圖3 各組HeLa 細(xì)胞凋亡圖 （×20）

圖4 各組HeLa 細(xì)胞增殖率和克隆形成率比較（±s，n=3）

3.2 不同濃度木犀草素對(duì)HeLa細(xì)胞Cyclin D1和Caspase-3表達(dá)的影響 5 μmol/L木犀草素組HeLa細(xì)胞Cyclin D1 mRNA、Caspase-3 mRNA、Cyclin D1蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；10、20 μmol/L木犀草素組HeLa細(xì)胞Cyclin D1 mRNA和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，Caspase-3 mRNA和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖5～6）。故本實(shí)驗(yàn)選擇較低濃度（10 μmol/L）木犀草素加入通路抑制劑作為抑制劑組進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以研究木犀草素對(duì)NF-κB通路的調(diào)控作用。

圖5 各組HeLa 細(xì)胞Cyclin D1 和Caspase-3 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖6 各組HeLa 細(xì)胞Cyclin D1 mRNA、Caspase-3 mRNA、Cyclin D1 蛋白、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=3）

3.3 NF-κB抑制劑加劇木犀草素促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖抑制和凋亡 克隆和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L木犀草素組細(xì)胞增殖率和克隆形成率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抑制劑組細(xì)胞增殖率和克隆形成率低于10 μmol/L木犀草素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Hoechst 33258結(jié)果表明，10 μmol/L木犀草素組細(xì)胞凋亡數(shù)高于對(duì)照組，抑制劑組細(xì)胞凋亡數(shù)高于10 μmol/L木犀草素組。（見圖7～10）

圖7 3 組HeLa 細(xì)胞EdU 染色圖 （×20）

圖8 3 組HeLa 細(xì)胞克隆圖 （×20）

圖9 3 組HeLa 細(xì)胞凋亡圖 （×20）

圖10 3 組HeLa 細(xì)胞增殖率和克隆形成率比較（±s，n=3）

3.4 NF-κB抑制劑加劇木犀草素對(duì)HeLa細(xì)胞Cyclin D1和Caspase-3表達(dá)的影響 10 μmol/L木犀草素組Cyclin D1 mRNA和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，Caspase-3 mRNA和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抑制劑組Cyclin D1 mRNA和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于10 μmol/L木犀草素組，Caspase-3 mRNA 和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于10 μmol/L木犀草素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖11～12）

圖11 3 組HeLa 細(xì)胞Cyclin D1 和Caspase-3 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖12 3 組HeLa 細(xì)胞Cyclin D1 mRNA、Caspase-3 mRNA、Cyclin D1 蛋白、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=3）

3.5 木犀草素抑制HeLa細(xì)胞NF-κB通路的活化 3組HeLa細(xì)胞NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；10 μmol/L木犀草素組HeLa細(xì)胞p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05）；抑制劑組HeLa細(xì)胞p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量低于10 μmol/L木犀草素組（P＜0.05）。（見圖13～14）

圖13 3 組HeLa 細(xì)胞NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖14 3 組HeLa 細(xì)胞NF-κB 和p-NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=3）

4 討論

宮頸癌是女性最常見的癌癥之一，防治手段主要是預(yù)防和治療高危型HPV宮頸癌感染。宮頸癌的治療以手術(shù)為主，可配合放療、化療等方法，但其預(yù)后不良，且影響患者術(shù)后生活質(zhì)量[13-14]。木犀草素（3,4,5,7-四羥基黃酮）是一種存在于多種蔬菜、中藥和水果中的一類黃酮類化合物，可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)抗人類各種類型的惡性腫瘤[15]，如非小細(xì)胞肺癌[16]、胰腺癌[17]和結(jié)腸癌[18]等腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)木犀草素處理HeLa細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖率、克隆形成率明顯降低，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，提示木犀草素可顯著抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。Cyclin D1是細(xì)胞增殖過程中標(biāo)志蛋白。作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和CDK6的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，Cyclin D1可調(diào)節(jié)從G1期到S期的轉(zhuǎn)變，Cyclin D1的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長[19]。Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，活化的Caspase-3包含2個(gè)p12亞基和2個(gè)p17亞基；Caspase-3能利用Cys殘基切割多種底物，調(diào)節(jié)有絲分裂后神經(jīng)元（PMN）和神經(jīng)前體細(xì)胞（NPC）中的程序性細(xì)胞死亡（PCD），在細(xì)胞凋亡中起重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素處理后，HeLa細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)水平明顯下調(diào)，Caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示木犀草素可能是通過下調(diào)Cyclin D1和上調(diào)Caspase-3來促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的增殖。

NF-κB是一類具有多向調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下細(xì)胞中NF-κB處于未激活、無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞被刺激后，磷酸化的NF-κB轉(zhuǎn)至細(xì)胞核與特定靶基因結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[9]。NF-κB被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可直接或間接控制癌細(xì)胞增殖、存活和抑制抗腫瘤免疫等[21]。有研究表明，木犀草素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路活化從而抑制骨肉瘤U20S細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]；人參皂苷Rg3可抑制宮頸癌細(xì)胞的體外增殖和轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[23]。但木犀草素是否可以通過NF-κB信號(hào)通路影響宮頸癌HeLa細(xì)胞的生物學(xué)行為尚不明確，因此，本研究在木犀草素基礎(chǔ)上加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑，探究木犀草素影響宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制。木犀草素處理后，HeLa細(xì)胞p-NF-κB表達(dá)水平降低；加入抑制劑后，p-NF-κB表達(dá)進(jìn)一步降低，提示木犀草素可抑制HeLa細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路，推測木犀草素可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路來抑制HeLa細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡的。這一研究結(jié)果與木犀草素干預(yù)肺癌[24]和人舌鱗癌[12]的研究結(jié)果相符。

綜上所述，木犀草素可顯著抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡能力，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究為木犀草素治療宮頸癌提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本研究僅在NF-κB信號(hào)通路調(diào)控上證明木犀草素與HeLa細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)，是否存在其他通路調(diào)控該細(xì)胞以及是何種基因啟動(dòng)誘發(fā)細(xì)胞的增殖和凋亡有待進(jìn)一步的研究。