毛躍程，邢代君，劉心寧，蔡厚昊，黃國(guó)棟，曲泓霖，鄭 心

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033）

肺癌是一種臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要發(fā)病于肺部支氣管黏膜或腺體，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。我國(guó)肺癌發(fā)病率及死亡率居高不下?，F(xiàn)代研究[2]證實(shí)，腫瘤發(fā)生、發(fā)展與腫瘤宿主免疫狀況密切相關(guān)，細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤免疫中起主導(dǎo)作用，而淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)主要細(xì)胞免疫系統(tǒng)。外周血淋巴細(xì)胞（Peripheral blood lymphocyte）主要位于血液循環(huán)，該淋巴細(xì)胞由T細(xì)胞和B細(xì)胞組成[3-4]。在機(jī)體免疫細(xì)胞中，T淋巴細(xì)胞是數(shù)目最多、最重要的功能細(xì)胞，其細(xì)胞亞群主要包括CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，這些T淋巴細(xì)胞亞群在人體內(nèi)的比例直接影響免疫功能[5-6]。CD8+T殺傷性淋巴細(xì)胞與癌癥患者生存期[7]及對(duì)治療反應(yīng)密切相關(guān)[8]。CD4+輔助性T細(xì)胞高表達(dá)與一些高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)更為相關(guān)[9]；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）為CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，其動(dòng)態(tài)平衡在維持機(jī)體免疫防御、免疫監(jiān)視方面發(fā)揮重要作用[10-11]。自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）與B細(xì)胞同樣可殺傷腫瘤，在機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中同樣具有重要作用[12-13]。

漢黃芩素（Wogonin）來(lái)源廣泛，在黃芩、半枝蓮等多種中藥材中均有分布，屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用[14]。研究表明，漢黃芩素能促進(jìn)人肺癌細(xì)胞A549[15]、肝癌細(xì)胞HepG2[16]和乳腺癌mcf-7[17]等凋亡，但尚不清楚其是否能通過(guò)干預(yù)免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究采用中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)病因和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因病理造模方法，模擬肺癌患者常見(jiàn)氣虛體質(zhì)，用煙熏結(jié)合種植瘤方法建立肺癌氣虛證病證結(jié)合小鼠模型[18]，觀察漢黃芩素的抗腫瘤作用，并探討其作用機(jī)制是否與調(diào)控各淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠（N型）40只，4～6周齡，體質(zhì)量16～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006；小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，濕度（50±10）%。本研究中所有使用的實(shí)驗(yàn)方案均得到了青島市中醫(yī)醫(yī)院（市海慈醫(yī)院）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2021HC12LZ036。

LLC小鼠肺癌細(xì)胞株，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司公司。

1.2 藥物與試劑 漢黃芩素（批號(hào)：22012106）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：MA0212-Mar-18H）、胎牛血清（批號(hào)：F0223B）、0.25%胰酶-EDTA（批號(hào)：MA0232-Apr-11H）、雙抗-青鏈霉素（批號(hào)：MA0110）、細(xì)胞凍存液（批號(hào)：MA0401）、PBS緩沖液（批號(hào)：MA0015-Sep-10G2）均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；流式破膜固定液（批號(hào)：B360640）、APC780 anti-mouse CD3e 抗體（批號(hào)：B349356）、APC anti-mouse Foxp3抗體（批號(hào)：B13358685）、APC anti-mouse CD49b抗體（批號(hào)：B336797）均購(gòu)自BIOLEGEND（北京）生物科技有限公司；FITC anti-mouse CD8抗體（批號(hào)：2287200）、PE anti -mouse CD25 抗體（批號(hào)：2293919）、PE anti-mouse CD19抗體（批號(hào)：2376142）均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；PE-Cy7 anti-mouse CD4抗體（批號(hào)：A20334）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)：20220105）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)：5211106212）購(gòu)自上海美天旎生物技術(shù)貿(mào)易有限公司；巴比妥鈉（批號(hào)：57-34-2）購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；泰山（華貴）香煙購(gòu)自中國(guó)煙草公司；蘇木精-伊紅染色試劑盒（批號(hào)：abs9217）、中性樹膠（批號(hào)：abs9177）均購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 Celmate型細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）；BX61型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）；EG1150C型組織包埋機(jī)、RM2235型組織切片機(jī)、ST5010型全自動(dòng)組織切片染色機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BTH-I型攤烘片一體機(jī)（山東歐萊博公司）；Sigma1-14型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)sigma公司）。

1.4 造模與分組

1.4.1 LLC小鼠肺癌細(xì)胞培養(yǎng) LLC小鼠肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗-青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到90%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 氣虛型LLC種植瘤小鼠模型的制備與分組 用煙熏法建立小鼠氣虛模型[18]，每天10∶00∶00將小鼠放于300 L煙箱內(nèi)用香煙熏0.5 h（每天暴露2根香煙，每支香煙約燃煙10 min，在每一輪接觸香煙的間隔時(shí)間內(nèi)，讓小鼠休息10 min，以防止二氧化碳引起的窒息），1次/d，連續(xù)21 d。在小鼠的常見(jiàn)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)[19]中，遲證包括心率緩/遲；食量、飲水量減少；吻、軀體移動(dòng)減弱。虛證包括老年、發(fā)育不良；食量減少、體質(zhì)量減輕、去瘤體質(zhì)量減輕、消瘦、羸瘦；吻、軀體移動(dòng)減弱；精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、倦怠、朦朧欲睡、嗜臥；步態(tài)不穩(wěn)、活動(dòng)減少、行動(dòng)呆滯；呼吸微弱、蜷縮、扎堆、拱背；毛蓬松、豎立、無(wú)光澤、枯黃、稀少；眼裂變窄/眼瞇/閉目、眼中無(wú)神、瞳孔對(duì)光反應(yīng)減弱；肌力減弱；肛門脫垂；垂尾；爪舒展差、蜷縮、伸展無(wú)力、白嫩；尾、爪污物附著。遲證、虛證＞1項(xiàng)即可辨證為小鼠氣虛證。無(wú)菌條件下，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的LLC小鼠肺癌細(xì)胞，以1×107個(gè)/mL重懸于不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種于煙熏后氣虛模型小鼠右側(cè)腋窩皮下，每只接種約2×106個(gè)LLC細(xì)胞。造模6 d后進(jìn)行成瘤評(píng)價(jià)，于小鼠右側(cè)腋下觸及小米大小皮下結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，活動(dòng)度一般，邊界清楚，即為造模成功。共有30只小鼠進(jìn)行造模，造模成功25只。選擇造模成功小鼠24只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為漢黃芩素高劑量組、漢黃芩素中劑量組、漢黃芩素低劑量組、氣虛荷瘤組，每組6只。另取6只正常小鼠作為正常組。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠分別按25、50、100 mg/kg劑量灌胃給予漢黃芩素混懸液（5 mL/kg），正常組、氣虛荷瘤組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥15d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 氣虛證小鼠行為狀態(tài)表現(xiàn) 煙熏結(jié)束后，根據(jù)小鼠的常見(jiàn)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)[19]觀察小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)度、異常動(dòng)作及皮毛色澤等多種行為狀態(tài)。

1.6.2 小鼠體質(zhì)量變化及末次給藥后去瘤體質(zhì)量 從初次給藥前24 h（Day1）開始，每4 d稱量一次小鼠體質(zhì)量。末次給藥24 h（Day17）后，使用0.3%戊巴比妥鈉溶液以30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠后脫頸椎處死，剝除瘤體，稱量小鼠去瘤體質(zhì)量。

1.6.3 小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況及抑瘤率 與稱量小鼠體質(zhì)量時(shí)間節(jié)點(diǎn)一致，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑（A）及與長(zhǎng)徑垂直的最大寬徑（B），并計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積（V）=AB2/2。剝除瘤體，測(cè)量瘤質(zhì)量，并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（TGI）=（氣虛荷瘤組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量）/氣虛荷瘤組瘤質(zhì)量×100%。

1.6.4 小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)測(cè)定 小鼠處死后，取脾臟和胸腺。去除多余脂肪后稱定質(zhì)量，并計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)（mg/g）=[脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）]×10；胸腺指數(shù)（mg/g）=[胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）]×10。

1.6.5 小鼠腫瘤、肝臟和腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察 小鼠處死后，取腫瘤、肝臟和腎臟。用4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)脫水、包埋、切片，置于自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色。待染色結(jié)束并晾干后，采用中性樹膠封片，光鏡下觀察、拍照。

1.6.6 小鼠外周血中各免疫細(xì)胞計(jì)量 采用眼球摘除采血法將血液分別收集于抗凝管中，經(jīng)紅細(xì)胞裂解后，制備得到細(xì)胞懸液；再以每管106個(gè)細(xì)胞分別收集于EP管中。管中同時(shí)加入規(guī)定劑量的抗體CD3e、CD4、CD25、CD8、CD19、CD49b，混勻后于4 ℃下避光孵育30 min；使用PBS洗滌細(xì)胞，進(jìn)行固定、破膜，破膜后加入抗體Foxp3，混勻后繼續(xù)4 ℃避光孵育30 min。孵育完成后使用PBS洗滌細(xì)胞，然后重懸于100 μL PBS中。使用流式細(xì)胞儀分析輔助性T細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8-）、殺傷性T細(xì)胞（CD3+、CD4-、CD8+）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）（CD3+、CD4+、CD25+、Foxp3+）、NK細(xì)胞（CD3-、CD49b+）和B細(xì)胞（CD3-、CD19+）所占比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示；數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布與方差齊性檢驗(yàn)時(shí)采用單因素方差分析，否則采用秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖采用GraphPad Prism9.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況 煙熏造模結(jié)束后，正常（未煙熏）小鼠無(wú)撞擊、瞇眼、蜷臥等行為，活動(dòng)度活躍，皮毛光亮，精神狀態(tài)正常，飲食量正常；煙熏小鼠煙熏時(shí)有跳躍、撞擊表現(xiàn)，喜蜷臥，活動(dòng)度減弱，毛發(fā)脫落且蓬松凌亂，毛色發(fā)灰，欠光澤，精神萎靡，飲食量較未煙熏小鼠下降。在小鼠的常見(jiàn)證候辨證[19]中，煙熏后小鼠符合氣虛證體質(zhì)表現(xiàn)。（見(jiàn)圖1）

圖1 小鼠一般情況

2.2 各組小鼠體質(zhì)量比較 所有小鼠隨時(shí)間推移體質(zhì)量均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），即存在時(shí)間效應(yīng)。各組小鼠體質(zhì)量總體比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.104），即不存在分組效應(yīng)；各組小鼠于給藥前（Day1）、給藥第4天（Day5）、給藥第12天（Day13）、末次給藥24 h（Day17）體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥第8天（Day9），氣虛荷瘤組小鼠體質(zhì)量高于正常組（P＜0.05），漢黃芩素中、高劑量組小鼠體質(zhì)量均低于氣虛荷瘤組（P＜0.05）。隨時(shí)間推移，各組小鼠間體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度不一致（P=0.007），即時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)。（見(jiàn)表1、圖2）5組小鼠給藥結(jié)束后去瘤體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖3）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較 （±s，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較 （±s，g）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=455.272，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=2.144，P分組主效應(yīng)=0.104；F交互效應(yīng)=2.282，P交互效應(yīng)=0.007；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與氣虛荷瘤組比較，cP＜0.05。

組別n給藥劑量/[mg/(kg/d）]Day1Day5Day9Day13Day17FP正常組6-17.88±0.62 20.21±0.59 23.59±0.50 24.79±1.59 24.93±1.60 71.545 0.000氣虛荷瘤組6-17.24±0.50 22.20±0.59 26.06±1.29b 26.65±1.28 27.28±1.96 127.608 0.000漢黃芩素低劑量組 62517.39±1.06 21.51±2.34 24.57±2.50 25.55±2.90 26.79±1.76 93.716 0.000漢黃芩素中劑量組 65017.10±0.53 21.31±0.72 24.72±1.02c 25.31±1.33 25.97±1.57 93.095 0.000漢黃芩素高劑量組 610017.46±0.89 22.33±2.10 24.57±1.75c 25.17±1.83 25.85±2.08 78.065 0.000 F 1.6382.6494.0411.8881.749 P 0.1950.0560.0110.1430.170

圖2 各組小鼠體質(zhì)量交互效應(yīng)輪廓圖

圖3 各組小鼠給藥結(jié)束后去瘤體質(zhì)量比較 （±s，n=6）

2.3 各組小鼠瘤體體積及抑瘤率比較 所有小鼠瘤體體積隨時(shí)間推移均增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），即存在時(shí)間效應(yīng)。各組小鼠瘤體積總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），即存在分組效應(yīng)；給藥前（Day1），各組小鼠瘤體體積比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥第4天（Day5），漢黃芩素高劑量組小鼠瘤體體積明顯低于氣虛荷瘤組（P＜0.05）；給藥第8天（Day9）、給藥第12天（Day13）、末次給藥24 h（Day17），漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠瘤體體積均明顯低于氣虛荷瘤組（P＜0.01）。隨時(shí)間推移，各組小鼠間瘤體體積增長(zhǎng)幅度不一致（P=0.022），即時(shí)間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)。（見(jiàn)表2、圖4～5）與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組瘤體質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。漢黃芩素低、中、高劑量組抑瘤率分別為55.68%、56.84%、76.33%。（見(jiàn)圖6）

表2 各組小鼠瘤體體積比較 （±s，mm3）

表2 各組小鼠瘤體體積比較 （±s，mm3）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=27.043，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=10.769，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=2.227，P交互效應(yīng)=0.022；與氣虛荷瘤組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別n給藥劑量/[mg/(kg·d)] Day1Day5Day9Day13Day17FP氣虛荷瘤組6-33.34±10.41 101.73±30.36 393.337±153.61 1 317.17±547.47 2 004.29±954.34 36.355 0.000漢黃芩素低劑量組62532.89±15.99 68.35±32.39 141.07±75.66b297.35±169.49b708.82±160.39b 2.981 0.049漢黃芩素中劑量組65032.30±11.07 55.81±10.10 96.72±40.70b297.17±86.36b553.79±377.64b 3.912 0.020漢黃芩素高劑量組610032.37±6.3537.82±11.39a 74.11±19.50b179.17±52.83b347.14±98.94b0.975 0.447 F 0.5461.8905.3369.69011.975 P 0.6560.1640.0070.0000.000

圖4 各組小鼠瘤體體積交互效應(yīng)輪廓圖

圖5 各組小鼠瘤體大體觀察圖

圖6 各組小鼠瘤體質(zhì)量比較 （±s，n=6）

2.4 各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05），胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)與氣虛荷瘤組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖7）

圖7 各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較 （±s，n=6）

2.5 各組小鼠腫瘤及肝臟、腎臟組織病理變化 氣虛荷瘤組小鼠腫瘤組織細(xì)胞排列緊密，大小不一，細(xì)胞核染色深且形狀各異；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織可見(jiàn)較多處壞死區(qū)域，且腫瘤細(xì)胞的排列相對(duì)紊亂。（見(jiàn)圖8）

圖8 各組小鼠的腫瘤組織病理切片圖 （HE）

正常組、氣虛荷瘤組及漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠肝臟組織的肝細(xì)胞索間界限清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，胞漿界限明顯，未見(jiàn)明顯異常；腎臟組織的腎小球、腎小管等結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)明顯水腫及血管擴(kuò)張充血等病變。（見(jiàn)圖9）

圖9 各組小鼠的肝臟、腎臟病理切片圖 （HE，×400）

2.6 各組小鼠外周血輔助性T細(xì)胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05）；與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞比例均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組間小鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖10～11）

圖10 各組小鼠外周血輔助性T 細(xì)胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖11 各組小鼠外周血輔助性T 細(xì)胞亞群部分流式細(xì)胞圖

2.7 各組小鼠外周血?dú)訲細(xì)胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3+CD8+T細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.01）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD8+T細(xì)胞比例與氣虛荷瘤組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖12～13）

圖12 各組小鼠外周血?dú)訲 細(xì)胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖13 各組小鼠殺傷性T 細(xì)胞亞群部分流式細(xì)胞圖

2.8 各組小鼠外周血CD4+/CD8+比值比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD4+/CD8+比值明顯降低（P＜0.01）；與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD4+/CD8+比值均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組間小鼠外周血CD4+/CD8+比值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖14）

圖14 各組小鼠外周血CD4+/CD8+比值比較 （±s，n=6）

2.9 各組小鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）（Treg）亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.01）；與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；漢黃芩素低、中、高劑量組間鼠外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖15～16）

圖15 各組小鼠外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）亞群比例比較（±s，n=6）

圖16 各組小鼠外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）亞群部分流式細(xì)胞圖

2.10 各組小鼠外周血B淋巴細(xì)胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3-CD19+B細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.01）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3-CD19+B細(xì)胞比例與氣虛荷瘤組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖17～18）

圖17 各組小鼠外周血B 淋巴細(xì)胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖18 各組小鼠外周血B 淋巴細(xì)胞亞群部分流式細(xì)胞圖

2.11 各組小鼠外周血中NK細(xì)胞亞群比例比較 與正常組比較，氣虛荷瘤組小鼠外周血CD3-CD49b+NK細(xì)胞比例有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD3-CD49b+NK細(xì)胞比例與氣虛荷瘤組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖19～20）

圖19 各組小鼠外周血NK淋巴細(xì)胞亞群比例比較（±s，n=6）

圖20 各組小鼠外周血NK 淋巴細(xì)胞亞群部分流式細(xì)胞圖

3 討論

在中國(guó)，肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[20]。在過(guò)去40年間，中國(guó)肺癌的死亡率增加約4倍，取代了胃癌成為癌癥死亡的最主要原因[21]。目前研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境污染、吸煙、職業(yè)接觸、電離輻射等多種因素有關(guān)，而自身的免疫狀態(tài)更與其有著十分密切的聯(lián)系[1]。肺癌患者體內(nèi)免疫功能抑制或紊亂可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃脫免疫細(xì)胞的“監(jiān)測(cè)”而“逃逸”，這不僅會(huì)使腫瘤細(xì)胞的惡性增殖不受控制，而且會(huì)大大增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)性[22-23]。因此，監(jiān)測(cè)肺癌患者免疫功能的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于選擇合適的治療方案及預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的意義十分重大。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌的基本病機(jī)在于正氣虧虛。本病病位在肺，吸煙、肺部基礎(chǔ)疾病等可導(dǎo)致肺陰虧虛、易感外邪，正氣不足而邪毒滯于體內(nèi)，內(nèi)外因相互作用引起氣機(jī)阻滯、臟腑失調(diào)，血液運(yùn)行不暢形成瘀血，而痰熱瘀毒聚于肺腑，共結(jié)為癌毒[24]。正如李中梓在《醫(yī)宗必讀》中所說(shuō)：“積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之。”本研究采用煙熏法以造模氣虛型小鼠[18]，后采用皮下接種LLC肺癌細(xì)胞制備小鼠種植瘤模型，模擬肺癌發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。

漢黃芩素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于黃芩、半枝蓮等中藥材，肝毒性和腎毒性均較低。本研究采用皮下接種LLC肺癌細(xì)胞制備小鼠種植瘤模型，以此探討漢黃芩素的抗肺癌作用以及其作用機(jī)制是否與調(diào)控各淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)。從瘤體體積、瘤體質(zhì)量及瘤組織的病理檢查結(jié)果來(lái)看，漢黃芩素干預(yù)能夠減緩腫瘤的生長(zhǎng)，與漢黃芩素的抗腫瘤活性相關(guān)研究結(jié)果[25-26]一致。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾臟和胸腺是重要的免疫器官，是衡量機(jī)體免疫能力的重要指標(biāo)[27]。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，既是T細(xì)胞和B細(xì)胞定居的場(chǎng)所，也是免疫應(yīng)答發(fā)生的場(chǎng)所。腫瘤會(huì)引起脾臟的腫大，而腫大的脾臟會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞明顯減少，嚴(yán)重影響機(jī)體正常的免疫功能[28]。T細(xì)胞的發(fā)育是由骨髓來(lái)源的淋巴樣祖細(xì)胞和支持性胸腺基質(zhì)微環(huán)境之間的相互作用協(xié)調(diào)的。而胸腺功能的下降則會(huì)導(dǎo)致抗腫瘤免疫功能受損，延遲癌癥患者的免疫重建[29]。在癌癥治療中，更好的全身免疫狀態(tài)意味著可以更持續(xù)的從外周血中募集抗腫瘤淋巴細(xì)胞，對(duì)于癌癥治療具有更好的意義[30]。T淋巴細(xì)胞亞群作為檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一，其對(duì)于某些疾病的診斷、分析發(fā)病機(jī)制、療效觀察及預(yù)后的預(yù)測(cè)均具有重要臨床價(jià)值[31]。作為抗腫瘤免疫的一個(gè)重要組成部分，外周血CD4+T細(xì)胞有助于調(diào)節(jié)和促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的啟動(dòng)、遷移潛力和殺傷活性[32]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，更高水平的CD4+T細(xì)胞與更好的療效及更長(zhǎng)的PFS相關(guān)[33]。CD4+T細(xì)胞亞群在識(shí)別免疫治療前臨床受益者，預(yù)測(cè)免疫治療效果和患者存活率方面有很大價(jià)值[34]。與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠CD4+T細(xì)胞水平較高，這說(shuō)明漢黃芩素可增加CD4+T細(xì)胞數(shù)量，從而獲得更持久的抗腫瘤反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞可以擴(kuò)增分化成CTL，通過(guò)血液循環(huán)遷移浸潤(rùn)腫瘤以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[35]，所以高CD8+T細(xì)胞水平可以增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。然而有臨床試驗(yàn)[33-36]顯示，免疫治療有效組的外周血CD8+T細(xì)胞比例較基線組有所降低，故CD8+T細(xì)胞比例水平與抗腫瘤免疫可能與多種因素有關(guān)。CD4+/CD8+比值可以顯示機(jī)體免疫功能的狀態(tài)，是癌癥患者細(xì)胞介導(dǎo)免疫的標(biāo)志，其降低提示機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，可能誘發(fā)或加快腫瘤生長(zhǎng)[37-38]。與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血CD4+/CD8+比值明顯升高，說(shuō)明漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠的免疫抑制狀態(tài)得到了明顯改善。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是以免疫抑制功能為特征的CD4+T細(xì)胞譜系，具有維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)、免疫監(jiān)視和預(yù)防自身免疫的作用[39]，對(duì)于預(yù)防所有組織的破壞性免疫至關(guān)重要[10]。與氣虛荷瘤組比較，漢黃芩素低、中、高劑量組小鼠外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）比例明顯增加，與臨床研究[33]所顯示的晚期非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療臨床受益組的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）較基線有所增加相符合，所以漢黃芩素對(duì)于LLC種植瘤小鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的升高作用可能具有積極意義。B細(xì)胞通過(guò)抗原呈遞激活T細(xì)胞，外周血B細(xì)胞的比例下降，表明體液免疫受損[40]。然而，多項(xiàng)研究[41]表明，激活的B細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有導(dǎo)致腫瘤發(fā)展的潛在危害，如B細(xì)胞介導(dǎo)抑制活化CD8+T細(xì)胞，促進(jìn)晚期非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)等[42]。NK細(xì)胞在腫瘤免疫檢測(cè)中具有積極作用，臨床研究證實(shí)，免疫治療臨床受益組外周血中NK細(xì)胞比例較基線有所增加，且基線NK細(xì)胞的比例越高，則臨床療效越好，患者更有可能獲得更長(zhǎng)的FPS[33,43-44]；NK細(xì)胞的活性也可作為生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)于免疫治療的反應(yīng)程度[45]。

綜上所述，在氣虛型LLC種植瘤小鼠模型上，漢黃芩素可以有效抑制種植瘤的生長(zhǎng)，提高外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞的比例，提高CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值，改善免疫狀態(tài)，從而更好地發(fā)揮免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。本研究結(jié)果可為將漢黃芩素開發(fā)為抗腫瘤免疫治療藥物提供參考，但漢黃芩素作用于淋巴細(xì)胞的機(jī)制尚不明確，這仍需要進(jìn)一步的研究。