金緯緯，林一禾，莊曉蘋，趙小迎

有研究顯示腫瘤干細(xì)胞（CSCs）在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥性等方面具有至關(guān)重要的作用[1-4]。但是如何精確識(shí)別、追蹤及靶向殺傷CSC是臨床治療子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵。集落刺激因子1（CSF1）是機(jī)體內(nèi)微環(huán)境中如腫瘤微環(huán)境和骨髓微環(huán)境常見(jiàn)的造血生長(zhǎng)因子，其在血液系統(tǒng)中參與了多種免疫反應(yīng)過(guò)程，可刺激造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)與分化，而在腫瘤微環(huán)境中，過(guò)往的研究顯示CSF1 在腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移、免疫逃逸、脂質(zhì)代謝、血管發(fā)生和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5-8]。有研究顯示，CSF1 也表達(dá)于各類實(shí)體腫瘤細(xì)胞中，尤其在CSCs 中呈現(xiàn)高表達(dá)[9]，但CSF1 在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究探討CSF1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，揭示其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Excell 公司），TRizol（Invitrogen）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（eBioscience 公司），SYBR Green PCR Kit（BD 公司），anti-CSF1 抗體（Abclonal 公司），anti-rabbit-IgG（Sigma公司），NC 模（上海時(shí)代生物科技有限公司），SDSPAGE 凝膠預(yù)制膠試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），Tween-20（上海生工生物工程有限公司），質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G、shRNA、人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存。超凈細(xì)胞工作臺(tái)和細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），低溫高速離心機(jī)（Hettich），移液器（Eppendorf），流式細(xì)胞分析儀（FACS Calibur），數(shù)字化成像設(shè)備（GE Healthcare），熒光倒置顯微鏡（Nikon），BIO-RAD凝膠電泳系統(tǒng)（伯樂(lè)公司）。細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組：子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞（腺癌）；對(duì)照組：正常內(nèi)膜細(xì)胞系ECT1/E6E7細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞株（腺癌），乳腺癌細(xì)胞株MCF7、胃癌細(xì)胞株SGC-7901、結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620。上述所有細(xì)胞株由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。本研究經(jīng)溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 CSF1 mRNA 水平表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（real-time PCR）檢測(cè)CSF1基因表達(dá)情況。1×106Ishikawa 細(xì)胞和1 ml Trizol 混合，按Trizol 說(shuō)明書抽提細(xì)胞RNA。CSF1 引物跨內(nèi)含子，所有引物序列由上海生工生物工程公司合成。引物：CSF1（108 bp）：上游5’- TGGCGAGCAGGAGTATCAC-3’，下游5’- AGGTCTCCATCTGACTGTCAAT-3’；ACTIN（101 bp）：上游5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’；下游5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’；BCL-2（108 bp）：上游5’- GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3’，下游5’- CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3’；BCL-X（108 bp）：上游5’- GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3’，下游5’-TCCATCTCCGATTCAGTCCCT3’；BAD（108 bp）：上游5’-CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3’，下 游 5’-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3’；BAK（108 bp）：上游5’-AGCAATGATCTGTTCACAACCG-3’，下 游 5’-CGCCATGTATAGCCCAGGC-3’；BAX（108 bp）：上游5’- CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3’，下 游 5’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3’。反應(yīng)在10l 的體系中進(jìn)行，其中2×實(shí)時(shí)熒光定量PCR 混合液5l、10mol/L的上下游引物各0.2l、樣本cDNA1（l50ng）、高壓處理過(guò)的去離子水3.8l。熱循環(huán)如下：95 ℃5 min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，32 個(gè)循環(huán)；72℃5min。應(yīng)用2- Ct法分析mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 CSF1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫印跡法檢測(cè)CSF1 蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。采用含有蛋白酶抑制劑RIPA蛋白裂解液，按照說(shuō)明書提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白量。采用BIO-RAD 凝膠電泳系統(tǒng)，置于足量的電泳液中，根據(jù)測(cè)得的蛋白濃度上樣，10%SDS-PAGE 膠電泳，恒壓80 V，90 min；電泳結(jié)束，將樣品轉(zhuǎn)移至NC 膜，恒流220mA，持續(xù)90min。用PBS 配置5%脫脂牛奶，室溫封閉1h，然后用PBS配置2%牛血清白蛋白按相應(yīng)濃度稀釋抗體，4 ℃輕搖孵育過(guò)夜。第2天，回收一抗，用含有0.1%Tween-20的TBST 洗NC 膜5 min，洗3 次；使用PBS 配制2%BSA，稀釋二抗，NC膜室溫孵育二抗1h，然后用含有0.1%Tween-20 的TBST 洗NC 膜5 min，共3 次。凝膠圖像采集及分析：采用CCD 攝像頭，Quantity One凝膠圖像處理系統(tǒng)，分析得出蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 慢病毒shCSF1 制備 1.5×106293T 細(xì)胞接種到10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 ml DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）中；24h后，將質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G和目的基因敲除shRNA 質(zhì)粒（敲除組）或?qū)φ战M質(zhì)粒，按照3∶1∶4 比例分別加入1.5ml無(wú)菌EP管中，再加入2.5mmol/L 氯化鈣50l，并用滅菌水補(bǔ)至500l，吹打混勻；將配置好的混合液逐滴加入500l 2×HBS，放置于室溫靜置30min。將上述混合液緩慢、逐滴加入至293T 細(xì)胞培養(yǎng)液中，4 h 后，換液，用10 ml 新鮮DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）更換原培養(yǎng)液；48 h 后，收取該293T 培養(yǎng)液上清液即慢病毒上清液。

1.2.4 構(gòu)建CSF1 敲除的子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系 將1×105/ml 子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa 細(xì)胞，接種至6 孔板，24 h后棄去孔內(nèi)原先培養(yǎng)基，將對(duì)照組及shCSF1慢病毒上清液加入孔內(nèi)，37 ℃2 000 r/min 離心感染2 h，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和免疫印跡法檢測(cè)感染shRNA 后CSF1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)shCSF1 敲除效率。采用流式細(xì)胞儀，分選綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，并繪制細(xì)胞增殖曲線檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 細(xì)胞凋亡染色 1×106子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，1000 r/min 離心5 min，棄上清液；用1×緩沖液（100l）重懸細(xì)胞，加入2l Annexin V 和PI，室溫下避光孵育30 min。1 000 r/min 離心5 min 沉淀細(xì)胞，1×緩沖液洗1 次，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.6 BAX特異性抑制劑BAI1 處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 BAX 特異性抑制劑BAI1 用DMSO 溶解，處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa 細(xì)胞濃度為1m，作用時(shí)間為24 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用GraphPadPrism7 軟件制作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來(lái)自3 個(gè)以上獨(dú)立樣本，每個(gè)樣品至少獨(dú)立重復(fù)3 次結(jié)果，兩組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析與Tukey 多重檢驗(yàn)。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞的CSF1 表達(dá)水平均高于正常內(nèi)膜細(xì)胞系及其他腫瘤細(xì)胞，而在mRNA表達(dá)水平上，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 中CSF1 相對(duì)表達(dá)水平均高于正常內(nèi)膜細(xì)胞ECC、MCF-7、SGC-7901、HELA 及SW620（均P ＜0.05），見(jiàn)圖1 ～2。

圖1 CSF1 在腫瘤細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平

圖2 CSF1 在腫瘤細(xì)胞中mRNA 表達(dá)水平

2.2 敲除CSF1 可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖抑制敲除CSF1 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，構(gòu)建2 條shCSF1 慢病毒載體，感染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa后，發(fā)現(xiàn)CSF1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（均P＜0.05），見(jiàn)圖3 ～4。同時(shí)獲取CSF1 敲除的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，并對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖速率進(jìn)行監(jiān)測(cè)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖受到抑制，見(jiàn)圖5。

圖3 靶向CSF1-特異性shRNA蛋白水平敲除效率

圖4 靶向CSF1-特異性shRNA mRNA 水平敲除效率

圖5 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖曲線

2.3 敲除CSF1 可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組細(xì)胞相比，CSF1 敲低組Ishikawa細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的水平上調(diào)，shCSF1-#1 和shCSF1-#2 組細(xì)胞凋亡率分別為45.04%和18.84%，均高于對(duì)照組Scramble組的3.32%（均P ＜0.05），見(jiàn)圖6 ～7。

圖6 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞敲除CSF1 后凋亡水平染色

圖7 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞敲除CSF1 后凋亡水平

2.4 CSF1 通過(guò)激活凋亡促進(jìn)因子BAX 誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌凋亡 結(jié)果顯示凋亡促進(jìn)因子BAX 在CSF1敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高，見(jiàn)圖8；利用BAX 特異性抑制劑BAI1，加入CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞培養(yǎng)基中，CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制得到緩解，見(jiàn)圖9；流式細(xì)胞染色結(jié)果也顯示在加入BAX特異性抑制劑后，CSF1 敲除組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡水平受到抑制（P＜0.05），見(jiàn)圖10 ～11。

圖8 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

圖9 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入BAX特異性抑制劑后細(xì)胞增殖曲線

圖10 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入BAX 特異性抑制劑后凋亡水平染色

圖11 CSF1 敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入BAX 特異性抑制劑后凋亡水平

3 討論

集落刺激因子家族是一類廣泛參與機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。以往的研究顯示CSF1 常表達(dá)于免疫相關(guān)細(xì)胞中，作為一類分泌性蛋白生長(zhǎng)因子，參與調(diào)控多種免疫反應(yīng)。其主要功能是通過(guò)識(shí)別免疫相關(guān)細(xì)胞表面特異性的受體蛋白，向免疫相關(guān)細(xì)胞內(nèi)傳遞免疫抑制性信號(hào)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞功能及活性抑制，維持機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡。但是這種調(diào)控方式一方面可維持機(jī)體正常的免疫功能，而在特殊環(huán)境中，如腫瘤微環(huán)境中，可造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，誘發(fā)機(jī)體腫瘤發(fā)生。有研究報(bào)道，CSF1 在腫瘤細(xì)胞中也呈現(xiàn)差異性表達(dá)，CSF1 對(duì)腫瘤干細(xì)胞在體內(nèi)外自我更新能力的維持具有重要作用[10]。相關(guān)研究顯示CSF1 也在神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及各類型腫瘤組織等不同組織來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)[11]，但其在這些細(xì)胞中，特別是在腫瘤干細(xì)胞中的作用、功能及調(diào)控機(jī)制尚未闡明[12]。

有研究顯示，mir-1254 通過(guò)抑制CSF1 表達(dá)，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。而在肺癌中，也有研究者發(fā)現(xiàn)抑制CSF1 表達(dá)可顯著抑制肺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移過(guò)程[9]。而在乳腺癌細(xì)胞中CSF1 高表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)乳腺癌的侵襲與遷移[14]。Aharinejad 等[15]研究顯示，乳腺癌患者血清中CSF1 水平越高，患者預(yù)后越差。而現(xiàn)有的關(guān)于CSF1 對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制研究主要集中在CSF1 家族成員參與免疫調(diào)節(jié)方面的作用[16]，但其針對(duì)CSCs本身功能和調(diào)控機(jī)制的研究較少，因而進(jìn)一步剖析CSF1 在CSCs 中的功能及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于臨床治療腫瘤具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示CSF1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中高表達(dá)；同時(shí)利用特異性shCSF1 慢病毒敲除技術(shù)靶向下調(diào)CSF1 表達(dá)，敲除組Ishikawa 細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，腫瘤細(xì)胞凋亡。這揭示了CSF1 誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。而在機(jī)制上，本研究發(fā)現(xiàn)CSF1-BAX 信號(hào)通路調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡過(guò)程，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其它凋亡相關(guān)BCL 家族蛋白成員，在CSF1 敲除后，也發(fā)生了變化，但是具體調(diào)控機(jī)制并不清楚；而凋亡相關(guān)BCL 家族蛋白成員多數(shù)位于線粒體內(nèi)，與線粒體功能密切相關(guān)。CSF1 敲除誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡是否與其細(xì)胞內(nèi)線粒體功能變化相關(guān)，是否會(huì)引起線粒體相關(guān)的代謝調(diào)控變化，是否能利用BCL 家族特異性抑制劑靶向殺傷腫瘤細(xì)胞或與常規(guī)化療藥物聯(lián)合用藥，克服臨床放化療耐受或腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及腫瘤復(fù)發(fā)等瓶頸，上述3 方面將是后續(xù)探究CSF1 在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制的重要方向。另一方面，腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了腫瘤細(xì)胞內(nèi)在因素外，腫瘤微環(huán)境也是調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的重要因素，目前研究主要集中在CSF1 蛋白家族成員參與免疫調(diào)節(jié)方面[16]，因而進(jìn)一步剖析CSF1 在腫瘤微環(huán)境中對(duì)CSCs 的調(diào)控機(jī)制，也將是后續(xù)的重要研究方向。