蘇智慧 張雷

（河南省南陽文和骨科醫(yī)院脊柱關節(jié)科 南陽 474250）

深靜脈血栓（Deep Vein Thrombosis,DVT）是創(chuàng)傷性骨折術后常見并發(fā)癥之一，其發(fā)生機制與血流速度緩慢、血管內(nèi)皮細胞受損及凝血功能異常有關，尤其是創(chuàng)傷性骨折老年患者下肢血管壁肌力減低、血流速度和血液回流能力減弱易造成血管內(nèi)皮損傷，進而激活內(nèi)源性凝血機制，加之老年患者多合并高血壓、糖尿病等基礎疾病更易誘發(fā)DVT[1]。若不能及時診斷和治療，可能引起肺栓塞，這也是導致住院患者致殘、致死的重要原因之一。隨著分子靶向治療成為臨床新的突破方向和熱點，多項研究表明，微小RNA（miR）通過調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、凋亡等多種作用機制，參與DVT 的發(fā)生發(fā)展過程[2]。miR-205 作為一種小分子非編碼RNA，被證實在DVT 患者單核細胞中呈高表達，但目前國內(nèi)外關于miR-205 與創(chuàng)傷性骨折術后DVT 形成的相關性研究甚少，缺乏可靠參考依據(jù)。另外，相關研究表明，炎癥反應是啟動DVT 形成的重要因素，而可溶性細胞表面分化抗原40 配體（Solublecell Surface Differentiation Antigen 40 Ligands,sCD40L）作為炎癥反應的關鍵分子，具有顯著的促炎和促凝作用[3]。因此推測sCD40L 可能在創(chuàng)傷性骨折術后DVT 形成過程中扮演著重要角色。鑒于此，本研究選取120 例創(chuàng)傷性骨折患者及50 名健康志愿者為研究對象，檢測其血清miR-205、sCD40L 的表達水平，旨在探討血清miR-205 聯(lián)合sCD40L 檢測對老年創(chuàng)傷性骨折術后DVT 形成中的預測價值?，F(xiàn)報道如下：

以貴州黔西項目為例，通過評估，該方案產(chǎn)生的人力成本、時間成本約是方案二的3倍。特別對于工期緊張的項目，可行性較低。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年1月南陽文和骨科醫(yī)院收治的創(chuàng)傷性骨折患者120 例，其中男73 例，女47 例；年齡60～78 歲，平均（68.12±3.26）歲；創(chuàng)傷原因：交通事故傷53 例，墜落傷30 例，跌打傷21 例，其他16 例；骨折類型：四肢骨折58 例，脊柱骨折45 例，骨盆骨折17 例。另選取同期50 名健康志愿者為對照組，其中男31 例，女19 例；年齡60～81 歲，平均（68.25±3.40）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲取醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 DVT 診斷標準 參照《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南（第三版）》[4]相關診斷標準，且術后經(jīng)彩色多普勒超聲檢查確診。彩超結果判定標準：（1）下肢靜脈管腔顯著增粗，管腔內(nèi)無回聲或低回聲；（2）血栓處無血流信號或自主性、激惹性血流；（3）形成側支循環(huán)、對Valsalva 運動反應減弱或消失。根據(jù)患者術后是否發(fā)生DVT，將納入的120 例創(chuàng)傷性骨折患者分為DVT 組（n=45）和非DVT 組（n=75）。

1.3 入組標準 納入標準：均經(jīng)CT 等影像學檢查確診為創(chuàng)傷性骨折；均為新鮮骨折，且接受手術治療；年齡≥60 歲，臨床資料完整；患者均知情，并自愿參與本研究。排除標準：病理性、陳舊性骨折者；合并骨惡性腫瘤者；術前合并DVT 者；近期有外科手術史或服用影響凝血功能藥物者；合并嚴重臟器功能不全者；合并嚴重感染、出血性疾病者；肢體功能障礙，長期臥床者；合并精神系統(tǒng)疾病、不能配合研究者。

1.4.1 標本采集 所有受檢者在空腹狀態(tài)下采集肘正中靜脈血清標本3～5 ml，置于抗凝管中，以離心半徑10 cm、離心轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心10 min，留取上層血清。

1.4 研究方法

2.1 三組血清miR-205、sCD40L 水平比較 DVT組血清miR-205、sCD40L 水平高于非DVT 組和對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

已有大量關于ENSO與中國夏季降水關系的工作(葉愈源,1988;Huang and Wu,1989;金祖輝和陶詩言,1999;趙亮等,2006)。研究表明東亞夏季風降水可能與ENSO循環(huán)的階段性有關,并建立ENSO與中國夏季降水的時滯相關模型,將其應用于業(yè)務預報,取得了一定成效。但ENSO 與中國夏季降水的關系具有不穩(wěn)定性(宗海峰等,2010)。中國夏季降水異?？赡芘cEl Nio事件的強度(薛峰和劉長征,2007)、與El Nio事件發(fā)生時最大暖海溫的位置(張志華和黃剛,2008;Feng et al.,2011;郭棟等,2016)有關。

2.2 血清miR-205、sCD40L 檢測對老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT 的診斷價值 血清miR-205、sCD40L 診斷老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT的曲線下面積（AUC）分別為0.901、0.855，靈敏度為82.2%、75.6%，特異度均為85.3%；血清miR-205 聯(lián)合sCD40L 診斷老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT 的AUC 為0.961，靈敏度為90.1%，特異度為94.7%，均高于上述指標單獨檢驗（P＜0.05）。見圖1、表2。

DVT 是在多種因素影響下導致凝血系統(tǒng)異常激活而形成的血栓栓塞性疾病，由于其缺乏特異性臨床癥狀，因此早期診斷較為困難，容易出現(xiàn)誤診和漏診。既往臨床針對DVT 診斷方法較多，但均具有一定的局限性，其中床邊超聲雖操作便捷，但診斷準確度及靈敏度有所欠缺，且易受主觀操作等因素影響；肺動脈增強CT 及下肢血管造影診斷準確率高，但價格昂貴，不可作為常規(guī)輔助檢查手段[5～6]。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗；計量資料以（x±s）表示，采用t、F檢驗；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-205、sCD40L 單獨及聯(lián)合檢測對老年創(chuàng)傷性骨折術后發(fā)生DVT 的診斷靈敏度、特異度。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

1.4.2 血清miR-205 檢測 采用實時熒光定量PCR 法（qRT-PCR）測定血清miR-205 表達，取上述血清標本采用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司提供）提取血清總RNA；采用RT-PCR 試劑盒（美國Biomiga 公司提供）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6 作為內(nèi)參基因；采用ABI7500 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司提供）進行qRT-PCR 實驗，miRNA 總反應體系：10 μl，包括5 μl SYBR，0.8 μl RNA 模板，0.2 μl TaqDNA 聚合酶，3 μl DEPC。反應條件：95℃5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，40 個循環(huán)，每個樣品設3 個復孔。采用2-△△CT法進行分析，計算miR-205 基因相對表達量。引物序列如下，上游：5'-AGAACTTATACTGAGTGAGG-3'， 下 游 ：5'-GAAGTCAAGATCGAATTG-3'。

表1 三組血清miR-205、sCD40L 水平比較（±s）

表1 三組血清miR-205、sCD40L 水平比較（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與非DVT 組比較，*P＜0.05。

組別nmiR-205sCD40L（ng/L）對照組非DVT 組DVT 組507545 F P 1.00±0.151.52±0.23#2.08±0.39#*197.0160.000108.45±30.06176.53±46.68#261.23±65.77#*116.7750.000

1.4.3 血清sCD40L 檢測 取上述血清標本，采用Victor X 型多功能酶標儀（美國Perkinelmer 公司提供），以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清sCD40L水平，試劑盒均購自武漢賽培生物，操作嚴格按照說明書進行。

圖1 血清miR-205、sCD40L 檢測診斷老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT 的ROC 曲線

表2 ROC 曲線分析血清miR-205、sCD40L 單獨及聯(lián)合檢測對老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT 的診斷價值（±s）

表2 ROC 曲線分析血清miR-205、sCD40L 單獨及聯(lián)合檢測對老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT 的診斷價值（±s）

指標AUC（95%置信區(qū)間）P最佳臨界值靈敏度（%）特異度（%）約登指數(shù)miR-205 sCD40L聯(lián)合檢測0.901（0.837～0.965）0.855（0.784～0.927）0.961（0.927～0.994）0.0000.0000.0001.75220.08-82.275.690.185.385.394.70.6750.6090.836

3 討論

陜西關中冬季往往干旱寒冷，梨黑星病菌主要以菌絲和分生孢子在病梢、芽鱗和病枝上，或殘存在落葉上越冬。在冬季溫暖潮濕年份，分生孢子易喪失生活力而不能越冬，但病菌轉(zhuǎn)而在落葉上形成菌絲團（12月）及子囊殼（1—2月）越冬，翌春再產(chǎn)生子囊孢子進行初次侵染。由于病菌能否形成子囊殼主要決定于冬季的濕度，因此在不同年份、不同地區(qū)，甚至同一地區(qū)不同小環(huán)境中，均可有不同的越冬方式。

對比三大斷裂的賦礦標高、礦體規(guī)模、傾角變化、熱液來源、礦石類型，認為其受相同應力場控制，處于同一構造系統(tǒng)內(nèi)，形成了對礦體賦存空間的約束，成礦特征高度一致，礦體的水平賦存深度和礦體規(guī)模也具有一致性，因此提出了“膠西北三大斷裂賦礦深度對稱和礦體規(guī)模對稱成礦”的找礦新思路，并在招平斷裂水旺莊礦區(qū)進行驗證，首次將勘查深度從-1500m延伸至-2200m以上，新增金資源量 110t ,至此招平斷裂提交金資源量達 1080t ,成為千噸級控礦斷裂。

隨著臨床研究的不斷深入，多項研究表明，不同種類的miR 在DVT 外周血中呈高表達或低表達現(xiàn)象，而miR 又對DVT 的嚴重程度和血栓范圍具有調(diào)控作用[7～8]。miR-205 位于第一號染色體LOC642587 位點上，可調(diào)控機體細胞中參與細胞代謝、分化等過程中相關基因表達，在多種疾病中異常表達。目前，臨床關于血清miR-205 在DVT 發(fā)生發(fā)展中的作用和潛在機制尚未完全闡明。Sun 等[9]研究表明，血清miR-205 過表達可增強內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)和體外血管生成、遷移、侵襲等，并抑制細胞凋亡。推測血清miR-205 可能通過靶向PTEN 調(diào)節(jié)Akt/ 自噬通路和MMP2 表達，參與DVT 發(fā)生發(fā)展。本研究結果顯示，DVT 組血清miR-205 水平高于非DVT組和對照組（P＜0.05）。說明血清miR-205 相對表達水平升高參與了DVT 的發(fā)生與發(fā)展，可作為診斷老年創(chuàng)傷性骨折術后發(fā)生DVT 的有效指標。

當機體血管局部缺血、缺氧時，血管內(nèi)皮細胞被誘導激活，導致大量黏附因子表達，繼而啟動內(nèi)源性和外源性凝血途徑，促進血栓進一步形成[10]。sCD40L 是一種血小板衍生介質(zhì)，廣泛分布于單核細胞、巨噬細胞等多種細胞膜上，可與B 淋巴細胞上的受體CD40 結合，發(fā)揮顯著的促炎和促凝作用。杜果城等[11]研究表明，與健康對照組相比，DVT 組患者外周血中sCD40L 表達水平顯著升高，且隨病情進展sCD40L 表達呈上升趨勢。王曉萌等[12]通過探討血清sCD40L 在產(chǎn)褥期下肢DVT 評估中的應用價值，結果發(fā)現(xiàn)血清sCD40L 水平增高，且與DVT 風險分級增加有關。本研究結果顯示，DVT 組血清sCD40L 水平高于非DVT 組和對照組（P＜0.05），與上述文獻報道一致。說明sCD40L 在老年創(chuàng)傷性骨折術后合并DVT 患者外周血中呈高表達。考慮原因可能是：sCD40L 通過與靶細胞CD40 受體結合，激活下游核因子-κB 信號通路，進而參與血管緊張素-Ⅱ依賴性炎癥反應和DVT 形成機制[13]。另外，本研究經(jīng)ROC 曲線分析顯示，血清miR-205 聯(lián)合sCD40L 診斷老年創(chuàng)傷性骨折患者術后發(fā)生DVT 的AUC 為0.961，靈敏度為90.1%，特異度為94.7%，均高于上述指標單獨檢測。說明血清miR-205 聯(lián)合sCD40L 可作為老年創(chuàng)傷性骨折患者術后DVT 高危人群早期篩查和診斷的生物學標志物。

綜上所述，血清miR-205、sCD40L 在老年創(chuàng)傷性骨折術后DVT 患者中表達水平顯著升高，兩者聯(lián)合檢測能提高DVT 的診斷效能。