范曉宇，徐子凱，柳雨菲，吳莞茹，李磊，何新怡，徐晶

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)專業(yè)，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生化教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

隨著我國(guó)人口老齡化和生活水平的提高，糖尿病患病率逐年上升，其中70%～80%為2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM），糖尿病是常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，常伴有糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病等糖尿病并發(fā)癥，胰島素抵抗是該病的主要特征，胰島素抵抗是由于胰島素分泌或者功能缺陷引起的綜合特征[1-4]。胰島素在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝方面具有重要作用，也是糖尿病患者管理血糖達(dá)標(biāo)的關(guān)鍵[5-9]。因此，對(duì)胰島β 細(xì)胞活力、功能及胰島素分泌情況的研究逐漸引起學(xué)者們關(guān)注。

大鼠胰島INS-1 細(xì)胞具有正常胰島β 細(xì)胞的大部分功能，能較好地對(duì)生理濃度葡萄糖的刺激做出應(yīng)答，分泌較多的胰島素，這種高度敏感性是由于細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除的酶類較少所致[10-12]。因此，本研究于2020年9 月—2021年6 月在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)院分子生物學(xué)中心完成體外高糖誘導(dǎo)大鼠胰島INS-1 細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度葡萄糖刺激胰島β 細(xì)胞的胰島素含量的變化，為選用提高胰島素分泌量的藥物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及主要試劑 大鼠胰島INS-1 細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Clark）；0.25%胰酶（gibco）；活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）檢測(cè)探針和葡萄糖（Sigma）；CCK-8 檢測(cè)試劑盒（上海生工）；大鼠胰島素（insulin）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（北京索來(lái)寶科技有限公司）。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀（Spark）；生物安全柜（Thermo）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS）；離心機(jī)（eppendorf）；激光共聚焦（ZEISS 710）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將大鼠INS-1 細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，37°C 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在1640 培養(yǎng)基中加入一定質(zhì)量的葡萄糖，待充分溶解后，0.22 μm 針孔過(guò)濾器過(guò)濾，配置成濃度為5.5、16.7、25、33、50 mmol∕L 的葡萄糖。實(shí)驗(yàn)分組：1640 正常培養(yǎng)組，即對(duì)照組（normal control, NC），不同濃度葡萄糖組，分別為5.5、16.7、25、33、50 mmol∕L。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率 將培養(yǎng)的100 μL大鼠胰島INS-1 細(xì)胞以5×104∕mL 密度的懸液接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，按照上述分組加入不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后，繼續(xù)孵育2 h 后在450 nm 處檢測(cè)吸密度（OD）值，根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）∕（對(duì)照孔-空白孔）×100%。

1.2.3 胰島素分泌檢測(cè) 將細(xì)胞以50 萬(wàn)∕孔的密度接種在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁率達(dá)到70%～80%時(shí)，按照上述分組分別加入不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后，收集上清和細(xì)胞沉淀。上清低速離心（1 000 rpm，1 min）棄掉細(xì)胞，沉淀用裂解液100 μL 冰浴裂解10 min，漩渦震蕩2～3 次，12 000 rpm 離心15 min，收集上清。將培養(yǎng)液上清和沉淀裂解上清分別按照大鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組胰島素釋放量和細(xì)胞內(nèi)含量。

1.2.4 ROS 水平檢測(cè) 將細(xì)胞以5 000 個(gè)∕孔的密度接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)黑色板中，貼壁后加入不同糖濃度培養(yǎng)48 h 后，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基配制的濃度為10 μmol∕L 的DCFH-DA 探針，置于37°C 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中30 min，PBS 清洗2 次，最后加入100 μL PBS，在酶標(biāo)儀中測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為521 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胰島INS-1 細(xì)胞的培養(yǎng)

將大鼠INS-1 細(xì)胞從-80°C 冰箱取出立刻放于37°C 水浴鍋中解凍，待溶解后將細(xì)胞打入含1640培養(yǎng)基的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠胰島INS-1 細(xì)胞的培養(yǎng)（20×）

2.2 不同濃度葡萄糖時(shí)大鼠INS-1 細(xì)胞活力比較

大鼠INS-1 細(xì)胞培養(yǎng)在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h 后，對(duì)照組（NC）（1.047±0.101）與體外5.5、16.7、25、33 mmol∕L 糖濃度時(shí)的大鼠INS-1 細(xì)胞活力[（0.933±0.100），（0.846±0.117），（0.884±0.035），（0.914±0.040）]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但糖濃度為50 mmol∕L 時(shí)，細(xì)胞存活率（0.727±0.096）顯著下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度葡萄糖時(shí)大鼠INS-1 細(xì)胞活力

2.3 不同濃度葡萄糖時(shí)大鼠INS-1 細(xì)胞胰島素釋放水平比較

與對(duì)照組比較，不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的INS-1 細(xì)胞胰島素釋放量、細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、胰島素總量都顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；33 mmol∕L 糖濃度時(shí)最低[（0.207±0.008）、（0.224±0.014）、（0.451±0.079）]，50 mmol∕L 糖濃度時(shí)有升高趨勢(shì)[（0.315±0.011）、（0.374±0.011）、（0.660±0.109）ng∕mL]。見(jiàn)圖3。

圖3 不同糖濃度時(shí)INS-1 細(xì)胞胰島素釋放水平

2.4 不同濃度葡萄糖時(shí)大鼠INS-1 細(xì)胞ROS 比較

在激光共聚焦顯微鏡下顯示，對(duì)照組（NC）細(xì)胞內(nèi)活性氧（1.028±0.065）與低濃度葡萄糖（5.5 mM）時(shí)（0.645±0.075）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)16.7 mM 后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平（1.85±0.102）也逐漸升高，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中33 mM 時(shí)最高（18.382±0.887），50 mM（3.209±0.607）比33 mM 低。見(jiàn)圖4。

圖4 不同糖濃度時(shí)INS-1 細(xì)胞活性氧水平

3 討論

糖尿病是全球致死率較高的疾病之一，目前尚無(wú)治愈糖尿病的技術(shù)手段。血糖代謝異常是糖尿病的主要特點(diǎn)，原因主要胰島素分泌不足和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）兩個(gè)因素。胰島β 細(xì)胞數(shù)量及功能是關(guān)系到胰島素分泌量的關(guān)鍵，因此本文將尋找影響胰島素分泌的因素，進(jìn)而再研究保護(hù)胰島β 細(xì)胞功能的藥物[13-19]。

本研究在體外使用不同濃度葡萄糖刺激大鼠胰島INS-1 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力在5.5、16.7、25、33 mmol∕L 糖濃度時(shí)，大鼠INS-1 細(xì)胞活力與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但糖濃度為50 mmol∕L 時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.05）。有研究表明體外葡萄糖濃度25 mmol∕L相當(dāng)于正常血糖值餐后高值7 mmol∕L[9]，體外葡萄糖濃度50 mmol∕L 時(shí)抑制胰島細(xì)胞活力，相當(dāng)于正常血糖值餐后高值14 mmol∕L。在不同濃度葡萄糖刺激下，胰島素釋放量都顯著減少（P＜0.05），33 mmol∕L 糖濃度時(shí)胰島素釋放量最低，50 mmol∕L糖濃度時(shí)胰島素釋放量有升高趨勢(shì)，細(xì)胞內(nèi)胰島素含量和胰島素總量變化趨勢(shì)與胰島素釋放量一致，提示大鼠胰島INS-1 細(xì)胞在受葡萄糖刺激時(shí)分泌胰島素總量會(huì)隨著濃度的升高逐漸降低，當(dāng)50 mmol∕L 糖濃度時(shí)，胰島細(xì)胞應(yīng)激性提高胰島素的分泌量來(lái)維持血糖的穩(wěn)定，本研究預(yù)測(cè)隨著糖濃度的再升高，胰島素將無(wú)法維持血糖平衡，因?yàn)橐葝uβ 細(xì)胞數(shù)量及功能是有限的。在活性氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，體外低濃度葡萄糖（5.5 mM）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)16.7 mM 后細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平也逐漸升高（P＜0.05），其中33 mM 時(shí)最高，然而50 mM 時(shí)活性氧水平比33 mM 低，但與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示當(dāng)葡萄糖濃度在50 mM 時(shí)細(xì)胞內(nèi)可能啟動(dòng)抗氧化應(yīng)激來(lái)抵抗高糖對(duì)細(xì)胞損傷的機(jī)制，這個(gè)結(jié)果與胰島素釋放量保持一致，因此驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生與胰島素抵抗密切相關(guān)。

綜上所述，不同濃度葡萄糖影響大鼠胰島INS-1 細(xì)胞胰島素釋放量和細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，將為體外高糖損傷模型的建立和臨床藥物的選取提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。