于聰祥，李躍飛，劉亞萍*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010012）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）在全球女性惡性腫瘤中的發(fā)病率及病死率位居第四[1]，約85%卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于中晚期[2]，5 年總生存率低于30%[3]，預(yù)后相對(duì)較差，并且有年輕化趨勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外面臨的瓶頸是缺乏有效的篩查手段，難以對(duì)卵巢癌進(jìn)行早期診斷以及精準(zhǔn)治療。研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移與p53突變率、p16和Ki67的高表達(dá)率具有顯著相關(guān)性，有助于進(jìn)行臨床診斷，可能作為診斷和預(yù)后的特異性抗體指標(biāo)[4]。然而p53 突變率、p16 和Ki67 的表達(dá)率不能應(yīng)用于卵巢癌的早期篩查及早期診斷。血清糖類抗原125（cancer antigen125，CA125）是MUC16 基因編碼的糖蛋白，在正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，在卵巢癌惡性腫瘤中卻呈顯著升高趨勢(shì)，廣泛應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷。然而其敏感性、特異性相對(duì)較低，并且假陽(yáng)性率相對(duì)較高[5]。相當(dāng)多的患者難以實(shí)現(xiàn)早期診斷，而錯(cuò)失治療時(shí)機(jī)。微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）是在惡性腫瘤中新近發(fā)現(xiàn)的一類影響腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要生物學(xué)標(biāo)志物。miRNA 是由20～22 個(gè)核苷酸組成的一類內(nèi)源性、不編碼蛋白質(zhì)的小型非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后通過(guò)靶向互補(bǔ)的DNA 和miRNA 序列調(diào)控基因表達(dá)[6]。目前的研究熱點(diǎn)主要集中在試圖將miRNA 作為癌癥的早期診斷指標(biāo)。然而關(guān)于miRNA 與卵巢癌的研究仍處于起步階段，miRNA 能否聯(lián)合CA125 作為卵巢癌診斷及治療的重要分子標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌的二級(jí)預(yù)防，是亟待解決的重要問(wèn)題。本課題擬通過(guò)測(cè)定卵巢癌患者血清中miR-29c、miR-93 表達(dá)情況，探討miR-29c、miR-93 在卵巢癌患者中的生物學(xué)特性，進(jìn)而分析其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016 年4 月至2018 年1 月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科因卵巢腫瘤住院的患者32例，其中卵巢癌患者20 例（包括卵巢上皮性惡性腫瘤14例、非上皮性惡性腫瘤6 例）、卵巢良性腫瘤（benign ovarian tumor，BT）12 例，所有患者入組前采集血液標(biāo)本，待術(shù)后病理確診方列入相應(yīng)組別。所有卵巢癌均行卵巢癌根治術(shù)。另隨機(jī)選取無(wú)卵巢腫瘤的正常健康女性（normal healthy women，N）12 例為對(duì)照組，采集血液樣本。研究組患者平均年齡（42.52±4.38）歲，對(duì)照組平均年齡（41.68±3.86）歲，對(duì)照組平均年齡（39.82±4.13）歲，組間比較平均年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，且本研究已獲得內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。入組前未接受放化療或激素藥物治療；不合并自身免疫系統(tǒng)疾病、其他臟器器質(zhì)性病變及惡性腫瘤等。

1.2 標(biāo)本采集

收集20 mL血液于EDTA管中，室溫下放置2 h，以3 000 rpm/min離心15 min，離心后將血漿勻漿等分于-80 ℃保存。

1.3 miRNA提取

根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，使用QiAzol Lysis Reagent（Qiagen，杜塞爾多夫，德國(guó)）裂解血清樣品。將miRNeasy 血清、血漿摻入對(duì)照（Qiagen）添加到裂解樣品中進(jìn)行miRNA提取。具體的提取過(guò)程如下：取200 μL 血清樣本，加入5 倍體積的裂解液，渦旋混勻，室溫靜置5 min；加3.5 μL control 工作液，混勻；加200 μL 氯仿，渦旋15 s，室溫放置3 min；4 ℃1 2000 rpm 離心15 min；取上清液至新EP 管，加1.5倍體積無(wú)水乙醇，渦旋混勻；將上述溶液移至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加700 μL RWT buffer至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加500 μL RPE buffer 至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加500 μL 80%乙醇至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心2 min，棄廢液及收集管；將吸附柱置于新的收集管上，室溫1 2000 rpm離心5 min；將吸附柱置于新的EP 管上，加入14 μL RNase-free water于吸附柱中央，靜置1 min，1 2000 rpm離心1 min；提好的RNA放到-80 ℃保存。

1.4 血清miRNA反轉(zhuǎn)錄

使用Mir-XTM miRNA 第一鏈合成試劑盒（Ta-KaRa，中國(guó)大連）。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行血清miRNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5 μL緩沖液、3.75 μLRNA、1.25 μL酶。反應(yīng)條件如下：37 ℃反應(yīng)1 h、85℃反應(yīng)5 min。4 ℃冷卻，用100 μL cDNA，-20 ℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

qRT-PCR反應(yīng)體系根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）說(shuō)明制備。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)反應(yīng)孔，并進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性（95 ℃，2 min）、變性（95 ℃，2 min）、退火（60 ℃，15 s）、延伸（72 ℃，30 s）、共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。上游引物由上海勝工生物工程有限公司提供。 mRQ 3'Primer作為下游引物（TaKaRa）。秀麗隱桿線蟲(chóng)miR-39 作為內(nèi)參基因。采用RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)[18]檢測(cè)血清中特定miRNA 的相對(duì)表達(dá)量。將所研究的miRNA 的每個(gè)循環(huán)閾值（Ct）用內(nèi)源參考miRNA的Ct（ΔCt）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，ΔCt=平均值Ct（參考miRNA）-平均值Ct（目標(biāo)miRNA），特定的miRNA 相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-Δct值表示。BT 或OvCa 組的每例患者均以正常健康女性組的平均值（N 個(gè)）（ΔΔCt）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。ΔΔCt=平均值Ct（來(lái)自N 個(gè)正常健康女性miRNA 的平均值）-平均值Ct（來(lái)自BT 或OvCa 的miRNA的平均值），特定的miRNAs相對(duì)陰性對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量采用2-Δct值表示。

1.6 引物

RT- qPCR 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物采用Primer 5軟件和NCBI Primer- BLAST 進(jìn)行設(shè)計(jì)，Tm 值在60 ℃上下浮動(dòng)，引物設(shè)計(jì)均符合RT-qPCR 正常進(jìn)行的要求。具體引物見(jiàn)表1。內(nèi)參基因miR- 39（miRNeasy?Serum/ Plasma Spike- In Control），U6 引物（Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit），3′microRNA Primer 通用下游引物（Mir- X?miRNA First-Strand Synthesis Kit）均由試劑盒提供。F 表示上游引物，R表示下游引物。

表1 引物列表

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用（±s）表示，利用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用[n（%）]表示，利用χ2檢驗(yàn)，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。通過(guò)受試者工作特征曲線（ROC）分析miRNA的診斷能力，并計(jì)算其下面積（AUC）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，預(yù)后采用Logistics回歸進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 主要指標(biāo)

本研究共納入44 位受試者，包括20 位OvCa 患者（其中包括上皮性卵巢癌患者14例、非上皮性惡性腫瘤6例）、12位良性卵巢腫瘤患者（BT）和12位正常健康女性（N），以評(píng)估外周血中差異表達(dá)的miRNA。

2.2 選擇miRNA

根據(jù)文獻(xiàn)資料，本實(shí)驗(yàn)選擇8 種miRNA 作為OvCa 患者候選生物學(xué)標(biāo)志物[7～9]，包括miR-29c、miR-93、miR-141、miR-21、miR-200a、miR-200c、miR-494-5p 和miR-let-7f2-5p。資料表明在OvCa患者中，上述miRNA在血清或組織樣本中的濃度均比正常健康女性更高或更低。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)了12位卵巢癌患者血清中8種miRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，OvCa 患者血清中miR-29c、miR-93相對(duì)濃度顯著高于BT患者或正常健康女性。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取miR-29c、miR-93 作為OvCa診斷的潛在血清miRNA指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證（見(jiàn)圖1）。

圖1 各組血清樣品中miRNA的表達(dá)情況

2.3 卵巢癌患者血漿中miR-29c 與miR-93 含量高于正常健康女性

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR 分別對(duì)20 位OvCa 患者血清的每種miRNA（miR-29c、miR-93）進(jìn)行了3 次測(cè)定，將3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的Ct值取平均值，并標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)部參比miR-39，以獲得Δct值。如材料和方法[10]中所述計(jì)算2-Δct和2-ΔΔct值。通過(guò)分析受試者血清樣品中的表達(dá)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化這兩種miRNA的qRT-PCR數(shù)據(jù)。

與BT 患者和正常健康女性相比，OvCa 患者血清中miRNA（miR-29c、miR-93）濃度更高。N、BT和OvCa 組中miR-29c 的平均相對(duì)濃度分別為0.003、0.015和0.053（見(jiàn)圖2A）。N、BT和OvCa組中miR-93的平均相對(duì)濃度分別為0.112、0.345 和0.630（見(jiàn)圖2B）。散點(diǎn)圖顯示，OvCa患者miR-29c和miR-93的血清濃度高于正常健康女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同組別miR-93濃度含量（OvCa 患者（n=20）、BT 患者（n=12）和正常健康女性（n=12）血清中miR-29c，miR-93的差異表達(dá)散點(diǎn)圖）。

2.4 miR-29c、miR-93 結(jié)合CA125 在OvCa 中的診斷價(jià)值

通過(guò)IBM SPSS Statistics 軟件對(duì)OvCa 患者血清中的miR-29c、miR-93 和CA125 進(jìn)行聯(lián)合分析。參照正常CA125（＜35 U/mL）范圍，選擇中位數(shù)18 U/mL作為正常健康女性組的CA125值，miR-29c、miR-93血清水平的差異顯著，OvCa 患者和健康正常女性miR-29c、miR-93、CA125及其組合的AUC值分別為0.599、0.538、0.893 和0.910。miR-29c、miR-93 與CA125組合可以區(qū)分OvCa患者和正常健康女性，敏感性為89%（見(jiàn)圖3）。miR-29c、miR-93、CA125 及其組合的敏感性和特異性由最高的約登指數(shù)確定（敏感性+特異性-1）?？傊?，將miR-29c、miR-93與CA125結(jié)合起來(lái)作為診斷OvCa的新方法是可行的。

圖3 ROC曲線分析

2.5 miR-29c 、miR-93 結(jié)合CA125 對(duì)OvCa 預(yù)后分析

該實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)卵巢癌癥20例患者中，隨訪到16例，其中4例因聯(lián)系方式改變而失訪，截止到2020年12月31日，所隨訪患者隨訪時(shí)間均為≥4年、＜5年，結(jié)局變量為是否復(fù)發(fā)。因變量為是否復(fù)發(fā)，賦值：0=未復(fù)發(fā)，1=復(fù)發(fā)。自變量為miR29C、miR93 和CA125。選擇Logistics 回歸進(jìn)行分析。經(jīng)Logistics回歸分析可知，miR29C、miR93 和CA125 對(duì)于是否復(fù)發(fā)沒(méi)有影響（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 預(yù)后影響因素篩選結(jié)果

3 討論

卵巢位于盆腔深處，早期病變不易被發(fā)現(xiàn)，目前臨床上缺乏有效的篩查手段。大多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀前來(lái)就診時(shí)已進(jìn)展為晚期卵巢癌。治療效果明顯降低，患者預(yù)后差、生存率極低。因此，尋找特異性標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌的二級(jí)預(yù)防，早發(fā)現(xiàn)、早診斷并進(jìn)行早期精準(zhǔn)治療是改善卵巢癌患者不良預(yù)后的關(guān)鍵。

miRNA是一組內(nèi)源性非蛋白編碼RNA，約占人類基因組的1%～5%。其廣泛參與基因的表達(dá)和信號(hào)通路的調(diào)控，主要功能是參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[6]。miRNA在腫瘤、炎癥等疾病中發(fā)揮重要作用，是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，關(guān)于miRNA在卵巢癌發(fā)病機(jī)制中的研究仍處于起步階段。2020年胡菊梅等通過(guò)qRT-PCR 法檢測(cè)卵巢癌組織中和正常卵巢組織中miR-29b和miR-187的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-29b在卵巢癌組織中呈低表達(dá)，而miR-187 呈高表達(dá)，提出miR-29b 和miR-187 與卵巢癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)，認(rèn)為miR-29b和miR-187可能共同影響卵巢癌不良預(yù)后[11]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miRNA-141 在卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞異常增殖，與卵巢癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[12]。miR-519a 通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，STAT3）發(fā)揮抑癌作用[13]。這表明多種miRNA可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明miR-29c是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)因子，miR-29c 通過(guò)靶向結(jié)合IGF-1 的3’-UTR，參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)、增殖和血管形成等[14]。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-29c 靶向抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管參與腫瘤形成。2015年穆鵬等[16]采用qRT-PCR對(duì)65 例卵巢癌患者經(jīng)手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中miR-29c表達(dá)水平高于正常組和良性腫瘤組。卵巢癌組miR-29c 表達(dá)水平與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，提出miR-29c 在卵巢癌診斷及病情評(píng)估方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，OvCa 患者血清中miR-29c 的濃度明顯高于卵巢良性腫瘤和正常健康女性的血清濃度（P＜0.05）。這提示miR-29c 可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管形成促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖侵襲，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過(guò)檢測(cè)血清miR-29c 的表達(dá)情況可能輔助診斷卵巢癌。

miR-93 是近年發(fā)現(xiàn)的位于染色體7922 上的miR-106b-25基因簇，在非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[17～19]。研究結(jié)果顯示[20]，miR-93 通過(guò)調(diào)控抑癌基因PTEN 發(fā)揮作用，過(guò)表達(dá)的miR-93 可阻斷細(xì)胞凋亡，與結(jié)直腸癌相關(guān)。miR-93 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞[21]和食管癌細(xì)胞[22]的異常增殖，其過(guò)表達(dá)還與膽管癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[23]。miR-93 在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯升高，過(guò)表達(dá)的miR-93 可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞由Go／G1期向S期演進(jìn)，提出miR-93 通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的演進(jìn)而參與胃癌的形成[24]。這提示miR-93 在癌癥中發(fā)揮著促癌基因的作用。課題前期研究，分別在卵巢癌細(xì)胞株（A2780）和正常卵巢上皮細(xì)胞株（IOSE-80）中提取得到miRNA，并采用qRT-PCR 檢測(cè)兩種不同細(xì)胞系中miR-93 的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-93 在卵巢癌細(xì)胞系中的水平明顯高于正常卵巢上皮細(xì)胞[25]。然而，陳說(shuō)等[26]研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌和卵巢交界性腫瘤中，miR-93的表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織，miR-93的表達(dá)水平與分化程度及FIGO 分期呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Lnc RNA TDRG1 通過(guò)抑制miR-93 進(jìn)而解除miR-93對(duì)Rho C（ras homolog family member c，Ras同源家族成員C）的靶向抑制作用，從而參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，OvCa患者miR-93的血清濃度顯著高于卵巢良性腫瘤組和正常健康女性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這提示miR-93可能抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞異常增殖及遷移能力，參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)檢測(cè)血清中miR-93的表達(dá)水平，可能提高卵巢癌的臨床診斷的準(zhǔn)確率。關(guān)于miR-93 在血清、卵巢癌細(xì)胞系中與卵巢癌組織中表達(dá)水平的差異，課題組將在今后研究中繼續(xù)探討。

miRNA 在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響[27]。血清中miRNA 具有穩(wěn)定性、耐受核酸酶活性以及易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可以作為腫瘤的非侵入性的生物學(xué)標(biāo)志物。檢測(cè)血液中表達(dá)明顯的miRNA 作為惡性腫瘤診斷手段已應(yīng)用于臨床。然而，迄今為止在臨床上還沒(méi)有miRNA 或miRNA 組被用作卵巢癌的生物標(biāo)記。本研究通過(guò)ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-29c、miR-93與CA125的結(jié)合在診斷OvCa方面比CA125更為靈敏和準(zhǔn)確，敏感性為89%。以上結(jié)果表明，miR-29c、miR-93 和CA125 的組合可能對(duì)卵巢癌的診斷具有潛在臨床意義。

綜上所述，miR-29c、miR-93 可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，miR-29c、miR-93 和CA125 的組合提高卵巢癌診斷的靈敏度和特異度，可能對(duì)卵巢癌的診斷具有潛在臨床意義。miR-29c、miR-93 或許可以作為預(yù)測(cè)卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究的不足之處在于樣本量不足，在后續(xù)研究中，課題組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步證實(shí)該研究的可靠性，并檢測(cè)miR-29c、miR-93在卵巢癌血清和癌灶組織中的表達(dá)情況，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究miR-29c、miR-93參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。