董 馨，李春燕，薛培鳳，陸景坤，王 智，王 辰，渠 弼

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

骨質(zhì)疏松是一種病因復(fù)雜的常見的進(jìn)行性骨骼疾病。其特征為單位面積內(nèi)骨組織量低于正常標(biāo)準(zhǔn)（T 值介于-1 g/cm3和1 g/cm3之間），易造成疼痛、骨折及駝背等，且患者結(jié)構(gòu)以老年人和絕經(jīng)后婦女為主。近年來，全球骨質(zhì)疏松患病率的激增給社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害，骨質(zhì)疏松現(xiàn)已成為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。對骨質(zhì)疏松生物標(biāo)志物的研究有助于做到對疾病的早發(fā)現(xiàn)和早預(yù)防，對降低患病率有重大意義[1，2]。

骨質(zhì)疏松是一種代謝性疾病，代謝組學(xué)被廣泛用于骨質(zhì)疏松的研究。代謝組學(xué)是繼蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)后新發(fā)展的一門學(xué)科，與其他組學(xué)的研究思想有相近之處，可通過對生物體液或機(jī)體各組織中存在的各種代謝物的識別來探究機(jī)體內(nèi)代謝物轉(zhuǎn)化的規(guī)律或機(jī)體在生理、病理刺激下的動態(tài)變化，為解釋骨質(zhì)疏松生理或病理機(jī)制提供另一種新的視角，成為骨質(zhì)疏松的預(yù)防、診斷和治療更簡捷的工具[3]。

1 代謝組學(xué)的研究方法

1.1 樣品采集和制備

1.1.1 樣本采集 在代謝組學(xué)研究中，樣本的選取和制備對代謝物的檢測結(jié)果有較大的影響，制備方案應(yīng)盡可能覆蓋所有的代謝產(chǎn)物。骨質(zhì)疏松代謝組學(xué)研究所選取的樣本有血液、尿液、糞便、膽汁及全身各組織[4]。血液參與全身循環(huán)，包含大量的代謝物，能整體地反映機(jī)體的生理病理狀態(tài)，通常作為代謝組學(xué)樣本的首選。由于全血中同時包含細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)液，基質(zhì)的復(fù)雜性增加，在實(shí)際檢測中多對血清和血漿進(jìn)行分析[5]。糞便樣本通常用來分析機(jī)體與腸道菌群之間相關(guān)作用。尿液樣本中常含有藥物和工業(yè)產(chǎn)物，通常用來反映藥物代謝的最終狀態(tài)。尿液和糞便具有采樣便捷、可大量取樣等優(yōu)點(diǎn)，但由于樣本濃度差異較大、代謝物種類與含量參差不齊，增加定量難度[6]。組織樣本的選擇具有明確的目標(biāo)性，樣本含有豐富的代謝物信息，但制備方法較為復(fù)雜?？傊?，不同種類的研究需要選擇合適的樣本，以達(dá)到分析的準(zhǔn)確性和無偏向性。

1.1.2 樣品制備方法 生物樣品組成復(fù)雜，基質(zhì)干擾性強(qiáng)，為了提升待測樣品的分析準(zhǔn)確性，在檢測前都需經(jīng)過前處理，將待檢成分最大限度與基質(zhì)分離。常見的樣本前處理方法包括：直接稀釋進(jìn)樣法、溶劑沉淀法、離心超濾法及固相萃取法等。溶劑沉淀法被廣泛應(yīng)用于血清、糞便、組織、細(xì)胞等樣本，成本低，可用于高通量篩選，但操作復(fù)雜、準(zhǔn)確性低，操作過程中對樣品的稀釋易致成分缺失[7，8]。直接稀釋進(jìn)樣法適用于尿液樣本，操作便捷，可降低溶劑對儀器分析的影響，減少被分析物的丟失。離心超濾法在處理各種生物樣本時，無需加入沉淀蛋白劑便可除去基質(zhì)中大部分高分子有機(jī)物質(zhì)，操作簡單、成本低廉，可保證檢測結(jié)果的靈敏度[9]。固相萃取法被譽(yù)為最具前景的樣本前處理方法，在處理生物樣本時能夠高效去蛋白，同時對樣本進(jìn)行濃縮，提升靈敏度和樣本回收率，降低分析誤差[10]。

1.2 高通量質(zhì)譜在樣品分析中的應(yīng)用

其分析和檢測主要依賴于高通量的質(zhì)譜（mass spectrograph，MS）。MS具有較高的靈敏度，數(shù)據(jù)掃描范圍廣、速度快，對于熱不穩(wěn)定、易揮發(fā)、不易衍生化和相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)同樣適用。而且近年來質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫和分析軟件也得到了快速發(fā)展，這些優(yōu)點(diǎn)使得MS 在代謝組學(xué)研究中使用更為廣泛[11]。但是MS只能對化合物進(jìn)行鑒定，實(shí)現(xiàn)高通量要先將成分進(jìn)行高效分離，才能得到更好的分析效果。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）作為體內(nèi)成分分析的理想工具，可以同時對樣品進(jìn)行分離與檢測，實(shí)現(xiàn)樣品分析高效性[12，13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

代謝組學(xué)通過對生物體內(nèi)代謝物的變化情況分析，可識別出數(shù)千個甚至更多的變量數(shù)據(jù)。將龐大的數(shù)據(jù)量進(jìn)行空間模型擬合、理論計算、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換等過程是數(shù)據(jù)處理的一大難點(diǎn)，通常需要選擇合理的數(shù)據(jù)處理方式。

1.3.1 主成分分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種通過降維的原理，把多變量的空間轉(zhuǎn)化為幾個主成分空間的重要統(tǒng)計方法之一，通過對整個數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和概覽，揭示出各組數(shù)據(jù)的趨勢和離群值并獲得各變量之間的相似性和差異性信息[14]。數(shù)據(jù)信息通常需要擬合成各種直觀的可視化圖形表達(dá)信息，PCA 通常運(yùn)用主成分得分圖和主成分載荷圖表達(dá)各變量的相似性和差異性。

1.3.2 偏最小二乘判別分析 偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）是一種有效的統(tǒng)計方法，其原理與PCA 相似，將各個樣本分組分類，相較于PCA 更容易發(fā)現(xiàn)組間差異，尤其是對于樣本組間差異較小的分析更適合采用PLS-DA分析。

1.3.3 正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法。其最大的特點(diǎn)是可以去除變量X 中與變量Y 無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息主要集中在一個主成分中，從而使得模型相較于PLS-DA 更簡單，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[15]。OPLS-DA 可對兩個組別的樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析和判別，可以很清楚地展現(xiàn)兩組間變量的差異性。而這種差異性是通過S圖直觀地展示出來，在S圖中，可以清楚地顯示出各變量的差異程度，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表現(xiàn)差異性越高。這提示化合物更有可能成為生物標(biāo)志物。

1.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺

生物機(jī)體的代謝過程復(fù)雜，涉及的代謝物眾多，且代謝組學(xué)運(yùn)用到MS 和NMR 等高分辨率、高準(zhǔn)確性的分析儀器，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量大，數(shù)據(jù)的處理過程復(fù)雜。近年隨著代謝組學(xué)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的快速發(fā)展，相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件及平臺也得到快速發(fā)展。目前被廣泛使用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析平臺有XCMS、Compound Discover 以及Simca-P 等，且每個平臺都有其獨(dú)有的特點(diǎn)[16，17]。

XCMS是一個相對簡便的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺，有非常直觀的圖形界面來提供對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的峰值檢測、保留時間矯正、峰對齊以及統(tǒng)計學(xué)分析等完整的工作流程。在數(shù)據(jù)處理完成后可以獲得保留時間校準(zhǔn)前的總離子色譜圖、保留時間校正云圖、多維縮放和主成分分析等直觀的結(jié)果分析，接受大部分質(zhì)譜數(shù)據(jù)格式，且識別的真實(shí)性較好，適合非靶標(biāo)代謝組學(xué)的分析。

Compound Discover 是一款商用軟件，擁有著強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理分析能力。利用MS/MS 庫鑒定化合物，并用高分辨率的全質(zhì)譜同位素和MS/MS 數(shù)據(jù)來測定元素組成。Compound Discover 還可以通過t檢驗(yàn)、方差分析、主成分分析、PLS-DA、火山圖、盒型圖等進(jìn)行統(tǒng)計和統(tǒng)計學(xué)分析，可以查看趨勢圖以顯示峰值區(qū)域，每個組的平均峰值面積。雖然其數(shù)據(jù)處理能力較為強(qiáng)大，但由于其商用的性質(zhì)，限制了多數(shù)科研人員的使用。

Simca-P 也是一種多元化數(shù)據(jù)分析軟件，Simca-P提供了PCA、PLS-DA等模型的有效算法，可以方便的提取信息，在計算的同時給出了模型的各類統(tǒng)計量，提供了強(qiáng)大的輔助分析功能，保證了數(shù)據(jù)信息的有效性。Simca-P 通過簡單地操作就可對質(zhì)譜以及平臺運(yùn)算數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，將其繪制成各種所需的圖形，且操作具有高度自由性，可編輯成各種類型圖表。

2 代謝組學(xué)在骨質(zhì)疏松疾病機(jī)制研究中的應(yīng)用

骨質(zhì)疏松是以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病。隨著代謝組學(xué)研究的深入，越來越多與骨質(zhì)疏松疾病機(jī)制有關(guān)的代謝物被相繼發(fā)現(xiàn)，這些代謝物參與的生物學(xué)過程包括：能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝及微生物群代謝等。

2.1 能量代謝

相關(guān)研究顯示，骨質(zhì)疏松可能與能量代謝紊亂有關(guān)。成骨細(xì)胞分泌的非羧基化骨鈣素能通過干預(yù)機(jī)體內(nèi)的葡萄糖代謝進(jìn)而影響能量代謝，而能量代謝也能通過下丘腦、交感神經(jīng)調(diào)控骨生成和骨重塑。骨重塑過程中結(jié)晶磷酸鈣或原纖維膠原蛋白的降解需要大量的能量，當(dāng)能量代謝受到影響時，骨重塑也將受到影響[18]。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中的一個中間產(chǎn)物，參與ATP 合成。琥珀酸作為電子傳遞鏈的電子供體，是三羧酸循環(huán)中的另一個中間產(chǎn)物。通過代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)測得骨質(zhì)疏松大鼠模型血清的檸檬酸和琥珀酸水平均明顯降低，三羧酸循環(huán)受損。這說明能量代謝紊亂可干擾骨組織健康水平。

2.2 脂質(zhì)代謝

肥胖是誘導(dǎo)多種慢性疾病的因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松與肥胖也有著密切的關(guān)系?，F(xiàn)代臨床研究顯示，肥胖通過干擾成骨作用、破骨作用及骨代謝來誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松。Ye等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Omega-3和Omega-6 等多不飽和脂肪酸對預(yù)防骨質(zhì)疏松有積極的作用，可以影響鈣平衡，改變細(xì)胞膜功能，減少炎癥細(xì)胞因子或調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活的受體γ 來減慢骨骼吸收并促進(jìn)成骨細(xì)胞生成。LysoPC（18∶1）是甘油磷脂代謝中甘油磷脂酰膽堿的上游成分之一。研究顯示，去勢骨質(zhì)疏松大鼠模型中LysoPC（18∶1）水平顯著升高，說明脂質(zhì)代謝紊亂會對正常骨代謝造成一定影響，從而干擾骨骼健康[20]。

2.3 氨基酸代謝

多種氨基酸，如精氨酸、賴氨酸和谷氨酸等，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和分化。氨基酸會影響骨密度（bone mineral density，BMD），促進(jìn)骨骼健康[21]。丙氨酸在骨骼代謝中起著關(guān)鍵的作用，通過促進(jìn)胰島素樣生長因子以及膠原蛋白和肌蛋白的合成來影響骨骼代謝。Yu 等[22]研究BMD 低的絕經(jīng)后女性尿液發(fā)現(xiàn)丙氨酸含量顯著增加，推斷丙氨酸與骨質(zhì)疏松有著密切的聯(lián)系。Qi等[23]發(fā)現(xiàn)谷氨酸受體在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且有證據(jù)顯示谷氨酸的信號可調(diào)控骨的形成和吸收。

2.4 微生物群代謝

生物機(jī)體與體內(nèi)微生物群相互共生，微生物群可作用于腸道上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體的生理狀態(tài)。研究表明[24]，馬尿酸被作為骨質(zhì)疏松疾病的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，由腸道微生物將食物中的芳香化合物代謝為苯甲酸，隨后結(jié)合甘氨酸形成。代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠模型體液中的馬尿酸水平顯著降低。這提示糖皮質(zhì)激素可能干擾了腸道微生物群導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

3 代謝組學(xué)技術(shù)在骨質(zhì)疏松疾病診斷中的應(yīng)用

骨質(zhì)疏松是一種代謝性疾病。隨著疾病的發(fā)生，一些小分子代謝物的種類和數(shù)量也會隨之改變，這些改變可能早于臨床癥狀的出現(xiàn)。利用代謝組學(xué)技術(shù)監(jiān)測骨質(zhì)疏松相關(guān)生物標(biāo)志物的動態(tài)水平，能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷。Takeshi 等[25]通過對絕經(jīng)后婦女進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低骨量人群的尿素、肌酸以及多種氨基酸與正常人相比都有顯著的差異。Pontes等[26]通過對中國不同骨密度的女性進(jìn)行代謝組學(xué)研究，最終確定了?；撬?、乳酸以及多種氨基酸為骨質(zhì)疏松的生物標(biāo)記物。代謝組學(xué)從全局出發(fā)尋找與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，表征疾病所特有的代謝模式，樣品易獲取、技術(shù)高通量，在疾病早期診斷方面有很大的應(yīng)用潛力。

4 展望

近年代謝組學(xué)憑借其高靈敏度、全面的特點(diǎn)逐漸興起，為骨質(zhì)疏松的研究打開了新的思路，并發(fā)現(xiàn)了多個與骨質(zhì)疏松相關(guān)的生物標(biāo)志物及其代謝途經(jīng)，這些發(fā)現(xiàn)為臨床上預(yù)防、診斷和治療骨質(zhì)疏松提供了新的方法。高分辨率質(zhì)譜與多檢測器聯(lián)用也被用于疾病診斷，高通量和高靈敏度使得疾病診斷效率得到有效地提升。

盡管代謝組學(xué)已是廣大科研人員認(rèn)可的研究手段，但骨質(zhì)疏松病因復(fù)雜，只從代謝維度研究整體致病機(jī)理具有片面性。近年興起的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組技術(shù)可結(jié)合代謝組學(xué)從多個層面獲得病理狀態(tài)或藥物治療后的生理變化。將這些變化富集和追溯到最集中的通路和靶點(diǎn)，通過對基因、RNA、蛋白質(zhì)以及體內(nèi)小分子等整體變化物質(zhì)進(jìn)行綜合分析，反映出組織器官功能和代謝狀態(tài)，更加深入地對骨質(zhì)疏松進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的診斷和治療。但多組學(xué)整合技術(shù)尚未完全成熟，匹配臨床信息的多組學(xué)研究結(jié)合多樣本高通量分析仍是整合過程中的瓶頸，攻克多組學(xué)數(shù)據(jù)整合這道難題，并將之運(yùn)用于骨質(zhì)疏松的診斷和治療當(dāng)中是相關(guān)科研工作者的共同目標(biāo)。