杜曉鸝，金義輝，朱彥，蘇佳，李剛*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3.內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010013）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎和骨損傷為主要特點(diǎn)的慢性炎癥性自體免疫病變，可導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾[1]。其一般侵害周圍重要關(guān)節(jié)，并造成重要關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞、畸形和功能損害。主要特征表現(xiàn)為手、腳小關(guān)節(jié)的發(fā)炎，并往往伴隨著重要人體關(guān)節(jié)外器官損傷或血清類風(fēng)濕因子陽性，同時(shí)也可伴隨體質(zhì)量的驟降、低熱量和疲倦感等身體表現(xiàn)。更多的證據(jù)指出，RA患者會(huì)面臨更多的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，包括感染、惡性腫瘤和急性冠狀動(dòng)脈綜合征[2～4]。目前還不完全了解這種疾病發(fā)生的機(jī)制。有研究提出，不同的環(huán)境因素，如吸煙、職業(yè)和大氣因素可觸發(fā)刺激易感個(gè)體基因的RA 的發(fā)展，導(dǎo)致滑膜增生和骨骼破壞。RA 的最初發(fā)病階段與先天和適應(yīng)性免疫的變化密切相關(guān)，隨后形成了自身抗體，主要針對(duì)不同分子，也包括經(jīng)過修改后的自我表位。在發(fā)病的以下階段，先天的（如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）和適應(yīng)性免疫細(xì)胞（如B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞）都有助于慢性炎癥狀態(tài)的擴(kuò)增和持續(xù)。對(duì)RA發(fā)病機(jī)理中的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)、介質(zhì)和機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)新型精確的疾病修飾抗風(fēng)濕藥物提供了基礎(chǔ)[5]。

目前治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物主要包括疾病修飾劑（DMARDs），如磺胺嘧啶和甲氨蝶呤，以及最近使用的“生物制劑”，如抗TNF-α 藥物[6]?，F(xiàn)階段人們廣泛采用中西醫(yī)結(jié)合方式來治療和控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。那如三味（NRSW）片是中國(guó)傳統(tǒng)蒙藥，具消“黏”、除“協(xié)日烏素”、祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、散寒功效。其主要適用于風(fēng)濕、關(guān)節(jié)酸痛、腰腿冷疼、牙痛、白喉等病癥。其由制草烏、蓽茇、制訶子組成，該三味藥均為中、蒙醫(yī)使用的傳統(tǒng)植物藥。方中草烏殺黏、止痛、燥黃水為主；訶子調(diào)理體素為輔；蓽茇補(bǔ)胃火、祛巴達(dá)干赫依為之佐使。三藥聯(lián)用，對(duì)寒性黃水病、皮膚蟲病、白喉、炭疽等“黏”病均有功效[7，8]。然而，由于蒙藥基礎(chǔ)研究的起步相對(duì)較晚，對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理仍缺乏深入的研究[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為新型科學(xué)，融合并運(yùn)用了網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)生理學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析方法等多學(xué)科專業(yè)的研究手段與教學(xué)內(nèi)容，以實(shí)現(xiàn)立體化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的建構(gòu)，從系統(tǒng)整合的視角去探討醫(yī)藥與病理之間的聯(lián)系，其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)處理疾病的總體觀點(diǎn)和辨證論治基本原則相吻合。

1 資料與方法

1.1 那如三味片的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建

利用TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），Version 2.0[10]并結(jié)合BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/ index. php/）[11]數(shù)據(jù)庫，搜集“草烏”“蓽茇”“訶子”主要化學(xué)成分。

1.2 活性物質(zhì)篩選

本課題以口服給藥的生物利用度（oral bioavailability，OB）閾值OB≥30%和類藥性（druglikeness，DL）閾值DL≥0.18 為主要活性物質(zhì)的檢測(cè)要求[12]，將TCMSP 中有較高活性的物質(zhì)加以檢測(cè)，增加數(shù)據(jù)分析處理的價(jià)值。BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中通過設(shè)置Score cutoff to 20 及Adjusted P_value cutoff to 0.05相關(guān)參數(shù)進(jìn)行活性化合物的篩選提取。

1.3 活性成分-作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

利用TCMSP檢索活性成分靶點(diǎn)，整理收集到靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot（https://www.uniprot.org/uniprot/）以及Inparanoid8（http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi）數(shù)據(jù)庫，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，剔除沒有靶點(diǎn)的活性成分。

1.4 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

在PALM-IST 數(shù)據(jù)庫（http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/palmist_server.html）和COREMINE 數(shù)據(jù)庫（https://www.coremine.com/medical/）中搜索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)，整理后建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。利用活性成分靶點(diǎn)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)之間的匹配，得到那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，從而構(gòu)建潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.5 那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用IPA（ingenuity pathway analysis）應(yīng)用程序，通過輸入那如三味片活性成分的靶點(diǎn)建立藥物和疾病互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 疾病、功能和通路分析

通過IPA 技術(shù)對(duì)那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎潛在靶點(diǎn)進(jìn)行核心分析，以獲取與其相關(guān)疾病、功能和通路等的有關(guān)信息，分析預(yù)測(cè)那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

從小分子數(shù)據(jù)庫zink（https://zinc.docking.org/）下載小分子文件，從RCSB PDB（https://www.rcsb.org）下載大分子蛋白，通過Autodock 軟件對(duì)小分子和蛋白進(jìn)行處理、對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 那如三味片活性化合物篩選

通過TCMSP 和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫共收集到那如三味片化合物172 種，其中草烏含27 種、蓽茇含104種、訶子含41種。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18及Score cutoff to 20、Adjusted P_value cutoff to 0.05 作為篩選條件，篩選出生物活性物質(zhì)共33 種，其中草烏含10種、蓽茇含15種、訶子含8種。

2.2 那如三味片活性化合物-作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

應(yīng)用TCMSP 和BATMAN-TCM 分析平臺(tái)，得到那如三味片各活性化合物的靶點(diǎn)信息，經(jīng)去重后得到172個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 疾病數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

在PALM-IST 和COREMINE 數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，共獲取6 450個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)。將那如三味片活性成分靶點(diǎn)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)匹配后，得到124 個(gè)那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎潛在靶點(diǎn)。

2.4 那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將那如三味片活性成分靶點(diǎn)通過IPA應(yīng)用程序錄入數(shù)據(jù)庫，建立“New My Pathway”，通過“Diseases and Functions”搜索“Rheumatoid arthritis”將其加入同一個(gè)“New My Pathway”，利用“Tool-Path Explorer”功能分別構(gòu)建那如三味片及草烏、訶子、蓽茇治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖1、圖2（A、B、C）。通過IPA 網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)出47 個(gè)那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)，主要包括細(xì)胞/增長(zhǎng)因子：CXCL8、TNF、TNFSF11、IL6、IL10、IL1B、VEGFA；G蛋白偶聯(lián)受體：ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB2、OPRD1、DRD2、OPRM1、HTR2A、ICAM1；轉(zhuǎn)運(yùn)體：SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、ABCB1；代謝酶：MAOA、MAOB、CYP1A2、CYP2B6、DPAGT1、PTGS2、CA2、ACLY、PTGS1、XIAP、ACHE；離子通道：KCNJ15、GABRA1；激酶：LRRK2、CCNB1；核受體：PGR；肽酶：MMP9、MMP2、IGHG1、F10、CASP3；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)：NFKBIA、NCOA2、FOS、TP53 等。那如三味片各成分中，發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分主要有草烏中的脫氧烏頭堿（Deoxyaconitine）、烏頭堿（Aconitine）、中烏頭堿（Mesaconitine）、次烏頭堿（Hypaconitine）、惰堿（Ignavine）等；蓽茇中的蓽茇壬三烯哌啶（Dehydropipernonaline）、胡椒堿（Piperine）、蓽茇明寧堿（Piperlonguminine）等；訶子中的碎葉紫堇堿（Cheilanthifoline）、霹靂蘿芙辛堿（Peraksine）等。由表1 可知，那如三味片中不同活性成分可作用于相同的靶點(diǎn)，也可作用于不同的靶點(diǎn)，體現(xiàn)其多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。其中草烏活性成分主要作用靶點(diǎn)為多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4），它們是哺乳動(dòng)物SLC6（溶質(zhì)載體6）家族中的成員，所有SLC6 轉(zhuǎn)運(yùn)體均為Na+/Cl-依賴的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，根據(jù)SLC6 轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)化關(guān)系可以進(jìn)一步劃分為4 個(gè)亞科，單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體即去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A2）、多巴胺（SLC6A3）、血清素即5-羥色胺（血管收縮素）（SLC6A4），此3種同屬于一個(gè)亞科[13]。

圖1 那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 藥物中各成分治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖A.草烏治療RA網(wǎng)絡(luò)圖；B.訶子治療RA網(wǎng)絡(luò)圖；C.蓽茇治療RA網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 疾病、功能及通路分析

那如三味片活性成分靶點(diǎn)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)匹配后，得到124 個(gè)那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎潛在靶點(diǎn)。通過IPA 可以對(duì)這些潛在靶點(diǎn)進(jìn)行核心解析，得到這些生物分子所涉及的主要疾病包括神經(jīng)性疾病、組織損傷和畸形、心理障礙、炎癥疾病、免疫調(diào)節(jié)失常等（見圖3）。主要通路包括5-羥色胺受體信號(hào)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)、磷酸腺苷活化蛋白激酶信號(hào)等（見圖4）。這提示了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程與5-羥色胺受體的結(jié)合活性、炎癥、免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。其中ADRB2、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、MAOA、PTGS1、PTGS2、SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4、IL6、IL10、IL1B、TNF 等基因在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)生發(fā)展中可能有重大影響，如參與腺苷酸環(huán)化酶抑制的G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、腺苷酸環(huán)化酶抑制5-羥色胺受體信號(hào)通路、骨重塑、5-羥色胺受體代謝等生物過程，各通路對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)見表2。

表2 各通路權(quán)重及對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)

圖4 生物分子蛋白通路排序

2.6 那如三味片對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果分析

分子對(duì)接展示圖（見圖2）展示了配體與蛋白分子間的相互作用。分子對(duì)接結(jié)果（見表3、圖5）顯示那如三味片與多個(gè)靶點(diǎn)形成氫鍵作用，結(jié)合能≤-1.2 Kcal/mol，構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有較好活性。

表3 碎葉紫堇堿(Cheilanthifoline)、玫瑰樹堿（Ellipticine）胡椒堿(Piperine)與ADRB2、PTGS2、SLC6A4的分子對(duì)接

圖5 那如三味片對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)分子對(duì)接展示圖

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一類慢性炎癥病變，滑膜炎為其主要的病變特點(diǎn)。白細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜細(xì)菌的活化，導(dǎo)致了軟骨和骨的損傷。而日益增多的研究資料也證實(shí)了致炎細(xì)胞因子造成的發(fā)炎、細(xì)菌繁殖和激活在RA 的發(fā)生機(jī)理上起到了關(guān)鍵性作用。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析探討了蒙藥那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及通路。這些作用靶點(diǎn)主要包括單胺氧化酶A基因（MAOA）、腎上腺素能受體基因（ADRA1D、ADRA2B）、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4）、細(xì)胞/增長(zhǎng)因子（IL6、IL10、TNF）等；通路主要包括5-羥色胺受體信號(hào)、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)、磷酸腺苷活化蛋白激酶信號(hào)等。

血清素（5-羥色胺）是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在腦內(nèi)平衡中起著重要作用。最新的研究表明，血液中的5-羥色胺是成骨細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)因子，可以抑制骨形成[14]。因此，測(cè)量血清中5-羥色胺水平對(duì)診斷RA具有一定的臨床意義。本文對(duì)那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出主要通路包括5-羥色胺受體信號(hào)，在文獻(xiàn)中得到證實(shí)。

G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是一種跨膜受體蛋白，是膜蛋白中最大的家族，有人類基因組中的800多個(gè)基因編碼。GPCRs 包含7 個(gè)跨膜螺旋束，為配體提供結(jié)合位點(diǎn)[15]。GPCRs中含有許多特異性免疫受體，如β2-腎上腺素能受體（β2-AR）、前列腺素E2（PGE2）受體、趨化因子受體、腺苷受體等。這些受體通過介導(dǎo)細(xì)胞外刺激（包括光、蛋白質(zhì)、肽、小分子、激素、質(zhì)子和離子）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，積極參與細(xì)胞的病理和生理過程[16]。GPCRs信號(hào)通路在炎癥和免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[17]。本文經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出那如三味片治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要通路包括G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)，與文獻(xiàn)中的報(bào)道一致[14]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)論提示草烏的主要活性成分脫氧烏頭堿（Deoxyaconitine）、烏頭堿（Aconitine）、中烏頭堿（Mesaconitine）、次烏頭堿（Hypaconitine）、惰堿（Ignavine）、北烏頭堿（Beiwutine）、異烏頭堿（Isoaconitine）和紫草烏堿（Delavaconitine）主要參與了5-羥色胺受體信號(hào)通路（HTR1B、HTR3A、SLC6A4、MAOA）和多巴胺受體信號(hào)通路（SLC6A3、MAOA）。SLC 類可溶性載體成為細(xì)菌膜上的主要信號(hào)傳導(dǎo)者，是藥物進(jìn)出細(xì)胞的關(guān)鍵，在體內(nèi)藥物的處置過程、有效性以及不良反應(yīng)等方面起至關(guān)重要的作用[18]。治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物多為轉(zhuǎn)運(yùn)體底物，如柳氮磺胺吡啶和甲氨蝶呤等。了解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎下轉(zhuǎn)運(yùn)體的變化對(duì)于藥代學(xué)、藥效學(xué)研究和指導(dǎo)臨床用藥至關(guān)重要[19]。值得注意的是，草烏對(duì)腎臟的毒性主要通過SCN10A和SCN5A離子通道作用于3 個(gè)G 蛋白偶聯(lián)受體靶點(diǎn)（ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C），對(duì)心臟毒性主要作用于HSP90AB1 靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)全部來自于草烏中的惰堿（Ignavine）。草烏成分相當(dāng)復(fù)雜。研究已證實(shí)其有毒成分主要依賴雙脂型烏頭酸的水解及分解程度，動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)生草烏水煎劑在約2 h 時(shí)毒害程度最高，約4 h 時(shí)毒害程度則明顯降低。動(dòng)物中毒試驗(yàn)研究亦表明，生草烏潛在具有人體心血管循環(huán)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、神經(jīng)、腎、胚胎、生殖毒性作用等，因此妊娠期應(yīng)禁用。烏頭堿中毒目前還缺乏特效的解毒品，防治的關(guān)鍵是適時(shí)、合理地糾正慢性心律失常，保持生命體征穩(wěn)定，并同時(shí)給予洗胃、靜脈注射補(bǔ)液等處理措施。本文采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接的分析方法，得出了草烏腎毒與心臟中毒反應(yīng)有關(guān)的主要活性成份和靶點(diǎn)，為進(jìn)一步確定其中毒反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、中毒反應(yīng)機(jī)理，以及與炮制藥劑配伍的經(jīng)濟(jì)增效減脂機(jī)理，提供了依據(jù)[20]。惰堿是否對(duì)腎臟和心臟產(chǎn)生毒性及如何在炮制、提取等工藝中對(duì)草烏進(jìn)行減毒、去毒從而使那如三味片更加有效、安全地發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。綜上所述，那如三味片網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研發(fā)平臺(tái)的形成，不但對(duì)明確該蒙藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制及臨床作用特點(diǎn)、指導(dǎo)臨床定位和合理用藥具有重要意義，而且也為建立質(zhì)控指標(biāo)體系、設(shè)計(jì)與優(yōu)化蒙藥產(chǎn)品制備工藝流程等提供了依據(jù)。