譚婉清，王術玲，劉瀟瀟，黃俊忠（.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 50006；.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 50663）

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis（L.）Osbeck 的未成熟或近成熟的干燥外層果皮。前者習稱“毛橘紅”，后者習稱“光七爪”“光五爪”[1]，是“中國四大南藥”和“十大廣藥”之一，更是嶺南八大道地藥材之首，有著“一片值千金”的說法[2]?；偌t主要用于治療風寒咳嗽、痰多、久咳、氣管炎、哮喘、食積傷酒和嘔惡痞悶等。研究[3-7]表明，化橘紅具有顯著的化痰止咳、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、預防糖尿病心肌功能損傷等藥理作用。此外，日常將其泡水飲用，可用于緩解咳嗽、多痰、消化不良和炎癥等[8]，化橘紅也被用于制成解酒和抗氧化等相關的保健食品[9-10]，可見，化橘紅應用廣泛。中藥配方顆粒包裝密封性良好，不易變質(zhì)，便于運輸、貯存、保管，且可直接采用顆粒劑沖服飲用，服用劑量相對較小，也便于攜帶[11]。本研究建立化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的薄層色譜（TLC）鑒別和高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并測定其主要成分柚皮苷和野漆樹苷的含量，綜合分析比較配方顆粒與飲片湯劑間的共有特征組分群的相似性及其含量的等量性。同時，通過氨水噴霧引咳小鼠試驗和小鼠酚紅排泌祛痰試驗，觀察化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的藥效等效性，以期為中藥配方顆粒的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器TLC Visualizer 薄層數(shù)碼成像儀（廣州無線電集團有限公司）；LC-20AT 液相色譜儀（日本島津公司）；1290 Infinity Ⅱ超高壓液相色譜儀（美國Agilent 公司）；T1000 十分之一電子天平和T200 百分之一電子天平（常熱市雙杰測試儀器廠）；Sartorius BP211D 萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；XS205DU 十萬分之一電子天平（德祥科技有限公司）；C22-CS13 電陶爐（浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司）；TW12 水浴箱[優(yōu)萊博技術（北京）有限公司]；WP-UPT-10 實驗室專用超純水機（四川沃特爾水處理設備有限公司）；ZH-E11 超聲霧化器（江蘇航醫(yī)療設備有限公司）；L5S 紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；3-18R 臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試藥柚皮苷（批號：110722-201312）、野漆樹苷（批號：111919-201804），中國食品藥品檢定研究院；咳特靈膠囊，廣州白云山制藥總廠，批號：4220025；苯酚紅，天津市大茂化學試劑廠，批號：20160321；化橘紅配方顆粒，廣東一方制藥有限公司，每1 g 配方顆粒相當于飲片2.0 g，編號：kl1～kl6；化橘紅飲片，廣東一方制藥有限公司，編號：yp1～yp6；化橘紅飲片，廣州白云山中藥飲片有限公司，編號：yp0。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 動物SPF 級KM 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（18±2）g，廣州銳格生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2021-0059。實驗動物飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，實驗獲得廣州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理審查委員會批準（批件號：ZYD-2022-128）。動物飼養(yǎng)在恒溫環(huán)境下[（23±1）℃，12 h/12 h 明暗交替]，自由飲食飲水，定時更換小鼠墊料，適應性喂養(yǎng)1 周。

2 方法與結(jié)果

2.1 化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的薄層色譜比較

2.1.1溶液的配制

（1）柚皮苷對照品溶液 取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含60 μg 的溶液，即得。

（2）化橘紅飲片湯劑供試品溶液 分別取6 批化橘紅飲片各6 g，于250 mL 的燒杯中，加入100 mL水，蓋上玻片，浸泡30 min；大火煮沸轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，倒出藥汁至250 mL 容量瓶中；再加入80 mL水，重復煎煮30 min，合并藥汁，放冷；用水定容至刻度，搖勻，精密移取25 mL 于分液漏斗中；用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL；合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻；取4.2 mL至5 mL 試管中，置通風櫥自然揮發(fā)至1 mL，即得yp1、yp2、yp3、yp4、yp5、yp6 批湯劑試供試品溶液。

（3）化橘紅配方顆粒供試品溶液 分別取6 批化橘紅配方顆粒3 g 于250 mL 的燒杯中，加入150 mL沸水，沖化攪拌均勻，放冷；轉(zhuǎn)移至250 mL 的容量瓶中，并用水定容至刻度；搖勻，精密移取25 mL于分液漏斗中，用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL；合并正丁醇萃取液，水浴蒸干；用甲醇定容至25 mL，搖勻，取4.2 mL 至5 mL 試管中，置通風櫥自然揮發(fā)至1 mL，即得kl1、kl2、kl3、kl4、kl5、kl6 批顆粒供試品溶液。

2.1.2測定 吸取6 批化橘紅飲片湯劑供試品溶液、柚皮苷對照品溶液和6 批化橘紅配方顆粒供試品溶液各2 μL，分別點樣于同一高效硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸-水（8∶4∶0.3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱1 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示化橘紅配方顆粒和飲片湯劑各樣品斑點高度相似，且在柚皮苷相應的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

圖1 化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的薄層色譜圖Figure 1 TLC of Citri Grandis Exocarpium dispensing granules and their slice decoction

2.2 柚皮苷的含量測定

2.2.1溶液的配制

（1）柚皮苷對照品溶液 配制同“2.1.1”項下。

（2）化橘紅飲片湯劑供試品溶液 分別取6 批化橘紅飲片各6 g，于250 mL 的燒杯中，加入100 mL水，蓋上玻片，浸泡30 min。大火煮沸轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，倒出藥汁至250 mL 容量瓶中；再加入80 mL 水，重復煎煮30 min。合并藥汁，放冷，用水定容至刻度，搖勻，精密移取25 mL 于分液漏斗中；用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻；精密移取1 mL 至25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得yp1、yp2、yp3、yp4、yp5、yp6 批湯劑供試品溶液。

（3）化橘紅配方顆粒供試品溶液 分別取6 批化橘紅配方顆粒3 g 于250 mL 的燒杯中，加入150 mL沸水，沖化攪拌均勻，放冷；轉(zhuǎn)移至250 mL 的容量瓶中，并用水定容至刻度，搖勻，精密移取25 mL于分液漏斗中，用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL；合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻；精密移取1 mL 至25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得kl1、kl2、kl3、kl4、kl5、kl6 批顆粒供試品溶液。

2.2.2色譜條件 采用Ultimate?AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-醋酸-水（35∶4∶61）為流動相；檢測波長為283 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1。理論塔板數(shù)按柚皮苷峰計算應不低于1 000[1]。色譜圖見圖2。

圖2 柚皮苷的高效液相色譜圖Figure 2 The HPLC chromatograms of naringin

2.2.3方法學研究

（1）線性關系考察 取柚皮苷對照品適量，配成柚皮苷濃度分別為6.0、15.0、30.0、60.0、150.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得柚皮苷回歸方程為：Y=2.028×104X-1.434×104，相關系數(shù)（r）=0.999 9。結(jié)果表明柚皮苷在6.0～150.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關系良好。

（2）精密度試驗 取同一份柚皮苷對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果柚皮苷峰面積的RSD 為0.4%，表明精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗 取同一份yp0 供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、16、24 h 進樣，結(jié)果柚皮苷峰面積的RSD 為0.3%，表明柚皮苷在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（4）重復性試驗 分別按“2.2.1”項下化橘紅飲片湯劑供試品溶液制備方法平行制備6 份yp0 供試品溶液，精密吸取各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果柚皮苷含量的RSD 為2.3%，表明重現(xiàn)性良好。

（5）回收率試驗 分別精密移取重復性試驗項下萃取前的溶液0.5 mL 至分液漏斗中，加入適量柚皮苷對照，加水至25 mL，混勻，用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻。精密吸取各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果平均回收率為100.7%，RSD 為2.5%，表明方法準確度良好。見表1。

表1 柚皮苷的回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 1 Recovery test results of naringin（n=6）

2.2.4含量測定 分別精密吸取柚皮苷對照品溶液、6 批化橘紅飲片湯劑供試品溶液和6 批化橘紅配方顆粒供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果見表2。利用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以［M（P25，P75）］表示，采用威爾科克森符號秩檢驗。結(jié)果化橘紅配方顆粒和化橘紅飲片湯劑含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片湯劑柚皮苷含量相當。見表2。

表2 化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片湯劑中柚皮苷含量［M（P25，P75），n=6］Table 2 The content of naringin in Citri Grandis Exocarpium dispensing granules and their slice decoction［M（P25，P75），n=6］

2.3 野漆樹苷的含量測定

2.3.1溶液的配制

（1）野漆樹苷對照品溶液 取野漆樹苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL 含30 μg 的溶液，即得。

（2）化橘紅飲片湯劑供試品溶液 分別取6 批化橘紅飲片各6 g，于250 mL 的燒杯中，加入100 mL水，蓋上玻片，浸泡30 min，大火煮沸轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，倒出藥汁至250 mL 容量瓶中，再加入80 mL水，重復煎煮30 min。合并藥汁，放冷，用水定容至刻度，搖勻；精密移取25 mL 于分液漏斗中，用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL。合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻，即得yp1、yp2、yp3、yp4、yp5、yp6 批化橘紅飲片湯劑供試品。

（3）化橘紅配方顆粒供試品溶液 分別取6 批化橘紅配方顆粒3 g 于250 mL 的燒杯中，加入150 mL沸水，沖化攪拌均勻，放冷；轉(zhuǎn)移至250 mL 的容量瓶中，并用水定容至刻度；搖勻，精密移取25 mL于分液漏斗中，用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL；合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻，即得kl1、kl2、kl3、kl4、kl5、kl6 化橘紅配方顆粒供試品。

2.3.2色譜條件 COSMOSIL C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，以1%冰醋酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～14 min，25%～55%A；14～20 min，55%～25%A；20～29 min，25%A）；檢測波長為266 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1。理論塔板數(shù)按野漆樹苷峰計算應不低于3 000。色譜圖見圖3。

圖3 野漆樹苷的的高效液相色譜圖Figure 3 The HPLC chromatograms of rhoifolin

2.3.3方法學研究

（1）線性關系考察 取野漆樹苷對照品適量，配成野漆樹苷濃度分別為2.5、12.5、31.2、62.5、125.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得野漆樹苷回歸方程為：Y=2.126×104X+2.027×104，相關系數(shù)（r）=0.999 7。結(jié)果表明野漆樹苷在2.5～125.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關系良好。

（2）精密度試驗 取同一份野漆樹苷對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果野漆樹苷峰面積的RSD 為0.1%，表明精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗 取同一份yp0 供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、16、24 h 進樣，結(jié)果野漆樹苷峰面積的RSD 為0.3%，表明野漆樹苷在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（4）重復性試驗 分別按“2.3.1”項下化橘紅飲片湯劑供試品溶液制備方法平行制備6 份yp0 供試品溶液，精密吸取各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果野漆樹苷含量的RSD 為3.0%，表明重現(xiàn)性良好。

（5）回收率試驗 分別精密移取重復性試驗項下萃取前的溶液各12.5 mL 至分液漏斗中，加入適當野漆樹苷對照品，加水至25 mL，混勻。用飽和正丁醇萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容至25 mL，搖勻。精密吸取各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果回收率為94.3%，RSD為2.7%，表明方法準確度良好。見表3。

表3 野漆樹苷的回收率結(jié)果試驗（n=6）Table 3 Recovery test results of rhoifolin（n=6）

2.3.4含量測定 分別精密吸取野漆樹苷對照品溶液、6 批化橘紅飲片湯劑供試品溶液和6 批化橘紅配方顆粒供試品各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果見表8。利用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩組獨立樣本t檢驗。結(jié)果配方顆粒和飲片湯劑的含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明化橘紅配方顆粒與飲片湯劑國野漆樹苷含量相當。見表4。

表4 化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片湯劑中野漆樹苷含量（±s，n=6）Tabble 4 The content of rhoifolin in Citri Grandis Exocarpium dispensing granules and their slice decoction（±s，n=6）

表4 化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片湯劑中野漆樹苷含量（±s，n=6）Tabble 4 The content of rhoifolin in Citri Grandis Exocarpium dispensing granules and their slice decoction（±s，n=6）

注：*折算為飲片質(zhì)量含量

序號yp1 yp2 yp3 yp4 yp5 yp6含量/%0.24 0.16 0.14 0.10 0.24 0.16含量/%0.17±0.06序號kl1 kl2 kl3 kl4 kl5 kl6含量*/%0.20 0.14 0.16 0.15 0.20 0.14含量*/%0.16±0.03

2.4 化橘紅配方顆粒和飲片的特征圖譜的建立與比較

2.4.1溶液的配制

（1）對照品溶液 柚皮苷對照品溶液制備同“2.1.1” 項；野漆樹苷對照品溶液制備同“2.3.1”項。

（2）化橘紅飲片湯劑供試品溶液 分別取6 批化橘紅飲片6 g，于250 mL 的燒杯中，加入100 mL水，蓋上玻片，浸泡30 min。大火煮沸轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，倒出藥汁至250 mL 容量瓶中。再加入80 mL 水，重復煎煮30 min。合并藥汁，放冷，用水定容至刻度，搖勻，即得yp1、yp2、yp3、yp4、yp5、yp6 批化橘紅飲片供試品溶液。

（3）化橘紅配方顆粒供試品 分別取6 批化橘紅配方顆粒3 g 于250 mL 的燒杯中，加入150 mL 沸水，沖化攪拌均勻，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL 的容量瓶中，并用水定容至刻度，搖勻，即得kl1、kl2、kl3、kl4、kl5、kl6 批化橘紅配方顆粒供試品溶液。

2.4.2色譜條件 Waters ACQUITY HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，5%～15%A；5～10 min，15% A；10～15 min，15%～20%A；15～30 min，20%～50%A；30～35 min，50%～90%A；35～40 min，90%A）；檢測波長為320 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL·min-1；進樣量為1 μL。

2.4.3方法學研究 精密度試驗：取yp0 制備的化橘紅飲片湯劑溶液，連續(xù)進樣6 次，以柚皮苷色譜峰為參照峰S，化橘紅各特征峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。重復性試驗：平行制備6 份yp0 批化橘紅飲片湯劑溶液，按“2.4.2”項下條件進樣，以柚皮苷色譜峰為參照峰S，化橘紅各特征峰與S 峰的相對保留時間的RSD 均小于3.0%，表明該方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗：取同一份yp0 的化橘紅飲片湯劑溶液，在0、1、2、4、8、16、24、36 h 進樣，以柚皮苷色譜峰為參照峰S，化橘紅各特征峰與S 峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4特征圖譜測定結(jié)果 將柚皮苷對照品、野漆樹苷對照品、6 批化橘紅飲片湯劑溶液和6 批化橘紅配方顆粒溶液，按“2.4.2”項下條件測定，記錄色譜圖，以6 號峰為參照峰（S），計算其他各共有峰的相對保留時間，結(jié)果其相對保留時間的RSD＜0.2%。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 年版）分別建立化橘紅飲片湯劑和化橘紅配方顆粒對照特征圖譜，并進行比較，共有峰數(shù)目相同。見圖4。

圖4 化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的特征圖譜圖Figure 4 The charactertistics chromatograms of Citri Grandis Exocarpium dispensing granules and their slice decoction

2.4.5化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的相似度比較 將6 批化橘紅飲片湯劑和6 批化橘紅配方顆粒的特征圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 年版），以yp1 樣品特征圖譜為參照，進行多點校正和峰匹配，并生成對照特征圖譜，匹配數(shù)據(jù)后計算相似度。結(jié)果顯示，6 批化橘紅飲片湯劑和6 批化橘紅配方顆粒與對照圖譜的相似度均不低于0.9，6 批化橘紅飲片湯劑與6 批化橘紅配方顆粒的特征圖譜之間的相似度也均不低于0.9，表明化橘紅配方顆粒與飲片湯劑間成分種類基本相同，見表5。

表5 化橘紅配方顆粒和化橘紅飲片湯劑的相似度評價結(jié)果Table 5 Similarity evaluation results of Citri Grandis Exocarpium dispensing granules and slice decoction

2.5 氨水噴霧引咳小鼠試驗（止咳試驗）

2.5.1溶液的配制

（1）化橘紅湯劑溶液 取化橘紅飲片50 g，加入350 mL 水，室溫下浸泡30 min 后開始煎煮，煎煮時間為30 min，趁熱濾過；過濾后藥渣加水300 mL，再繼續(xù)煎煮30 min，趁熱濾過；合并濾液，濃縮至少于100 mL，放冷至室溫，加水至100 mL，混勻，即得0.5 g·mL-1（高劑量）的化橘紅飲片湯劑。取適量高劑量藥液分別稀釋至0.25 g·mL-1（中劑量）和0.05 g·mL-1（低劑量）的化橘紅飲片湯劑，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

（2）化橘紅配方顆粒溶液 取化橘紅配方顆粒25 g，加入80 mL 沸水使溶解，放冷至室溫，加水至100 mL，混勻，即得相當于化橘紅飲片0.5 g·mL-1的高劑量供試液。同法制備中、低劑量化橘紅配方顆粒供試液（相當于化橘紅飲片0.25、0.05 g·mL-1），4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

（3）咳特靈藥液 取咳特靈膠囊10 粒，傾出內(nèi)容物，精密稱定，稱取1 粒的質(zhì)量，用44 mL 溫水溶解，放冷至室溫，即得小葉榕干浸膏含量約為8.2 mg·mL-1、馬來酸氯苯那敏含量約為0.032 mg·mL-1的咳特靈溶液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

（4）5%酚紅溶液的制備 取5 g 苯酚紅，用少量1 mol·L-1的氫氧化鈉使溶解，用0.9%氯化鈉溶液定容至100 mL，混勻，即得。

2.5.2分組與給藥 取健康昆明種小鼠64 只，體質(zhì)量（18±2）g，雌雄各半，隨機分為8 組，分別為模型對照組，陽性藥對照組，化橘紅飲片低、中、高劑量組，化橘紅配方顆粒低、中、高劑量組。模型對照組給予0.9%氯化鈉溶液，陽性藥對照組給予咳特靈藥溶液，化橘紅飲片組和化橘紅配方顆粒組給予相應濃度藥液，每天1 次，每次按20 mL·kg-1灌胃，連續(xù)5 d。

2.5.3方法和結(jié)果 給藥前12 h 內(nèi)禁食不禁水，末次給藥1 h 后，將各組小鼠放入1 000 mL 鐘形玻璃罩中，用12.5%氨水噴霧15 s，觀察小鼠的咳嗽動作（張大嘴，腹肌收縮，有時會有咳嗽聲），記錄小鼠的咳嗽潛伏期（小鼠放入鐘形玻璃罩中至出現(xiàn)咳嗽動作的時間）及2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)。采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊，采用LSD 檢驗。

與模型對照組相比，化橘紅飲片中、高劑量組和化橘紅配方顆粒低、中、高劑量組咳嗽潛伏期均明顯延長，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?；偌t配方顆粒與化橘紅飲片相應濃度組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6。與模型對照組相比，化橘紅飲片低、中、高劑量組和化橘紅配方顆粒中、高劑量組小鼠2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?；偌t配方顆粒與化橘紅飲片相應濃度組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表7?？梢?，化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片止咳效果相當。

表6 各組小鼠咳嗽潛伏期比較（±s，n=7）Table 6 Comparison of cough latency among each group of mice（±s，n=7）

表6 各組小鼠咳嗽潛伏期比較（±s，n=7）Table 6 Comparison of cough latency among each group of mice（±s，n=7）

組別模型對照組陽性對照組化橘紅飲片低劑量組化橘紅配方顆粒低劑量組化橘紅飲片中劑量組化橘紅配方顆粒中劑量組化橘紅飲片高劑量組化橘紅配方顆粒高劑量組潛伏期/s 23.7±6.4 38.9±8.8 26.4±5.1 31.7±9.5 43.1±6.2 44.0±3.3 51.3±6.2 53.4±4.6 P 值與模型組比較-0.000 0.442 0.027 0.000 0.000 0.000 0.000相同濃度兩組比較--0.138 0.808 0.544

表7 各組小鼠2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)比較（±s，n=7）Table 7 Comparison of cough frequency within 2 minutes amony each group of mice（±s，n=7）

表7 各組小鼠2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)比較（±s，n=7）Table 7 Comparison of cough frequency within 2 minutes amony each group of mice（±s，n=7）

組別咳嗽次數(shù)/次P 值相同濃度兩組比較模型對照組陽性對照組化橘紅飲片低劑量組化橘紅配方顆粒低劑量組化橘紅飲片中劑量組化橘紅配方顆粒中劑量組化橘紅飲片高劑量組化橘紅配方顆粒高劑量組76.1±12.3 55.7±6.8 64.9±6.8 70.9±6.0 58.7±8.7 56.4±4.8 52.6±8.9 46.6±4.7與模型組比較-0.000 0.009 0.207 0.000 0.000 0.000 0.000--0.153 0.583 0.153

2.6 小鼠酚紅排泌祛痰試驗（祛痰作用）

2.6.1溶液的配制 同“2.5.1”項下。

2.6.2分組與給藥 分組同“2.5.2”項下。模型對照組給予0.9%氯化鈉溶液，陽性藥對照組給予咳特靈溶液，化橘紅飲片組和化橘紅配方顆粒組給予相應濃度藥液，每天1 次，按20 mL·kg-1灌胃給藥，連續(xù)7 d。取酚紅適量，用1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液配制成每毫升含酚紅2、4、6、8、10 μg 的溶液。在546 nm 波長處測定吸光度值，以酚紅濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得酚紅回歸方程為：Y=0.068 3X+0.048 6，相關系數(shù)（r）=0.999 6。

2.6.3方法和結(jié)果 試驗開始前12 h 內(nèi)禁食不禁水，末次給藥0.5 h 后，各組小鼠分別按體質(zhì)量（10 mL·kg-1）腹腔注射5%酚紅溶液。0.5 h 后，處死小鼠，剪開頸部皮膚，小心分離氣管（操作過程中避免出血），剝離氣管周圍組織，剪取自甲狀軟骨氣管至氣管分支處的一段氣管放入試管。注入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液0.1 mL 和0.9%氯化鈉溶液2 mL，充分震蕩，離心，取上清液，在546 nm 波長處測定吸光度。代入回歸方程，計算酚紅的濃度。

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料中化橘紅高劑量組不符合正態(tài)分布，結(jié)果采用M（P25～P75）表示，采用曼-惠特尼檢驗。與模型對照組相比，化橘紅飲片中劑量組和化橘紅配方顆粒中、高劑量組小鼠酚紅排泌明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明化橘紅配方顆粒中、高劑量與化橘紅飲片湯劑中劑量能促進酚紅排泌?；偌t配方顆粒與化橘紅飲片相應濃度組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表8?？梢姡偌t配方顆粒與化橘紅飲片祛痰效果相當。

表8 各組小鼠酚紅排泌量的比較（n=6）Table 8 Comparison of the phenolsulfonphthalein excretion among each group of mice（n=6）

3 討論

在化橘紅配方顆粒與飲片湯劑的特征指紋圖譜研究中，對比了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-2%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液5 種不同流動相，結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，柚皮苷色譜峰峰型較好，且整體色譜峰比較豐富，故選用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相進行優(yōu)化梯度。在190～400 nm 范圍內(nèi)對供試品溶液進行掃描，在320 nm 下，色譜基線比較平穩(wěn)，色譜峰信息比較豐富，所以選擇320 nm 作為化橘紅特征圖譜的測定波長。比較了不同色譜柱[Waters ACQUITY HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACE Excel Super C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）]的特征圖譜。結(jié)果顯示，3 種色譜柱所獲得的化橘紅特征峰與參照峰相對保留時間的RSD 均小于3.0%，表明該方法耐用性良好。

化橘紅的有效成分中黃酮類化合物含量最高，是主要的生物活性物質(zhì)，柚皮苷和野漆樹苷又占到總黃酮含量的84%以上[12]。李吉華[13]實驗結(jié)果顯示，化州柚中野漆樹苷的含量遠高于普通柚子，野漆樹苷含量可以作為化州柚和柚來源的藥材鑒別特征之一，故本研究選擇柚皮苷和野漆樹苷作為指標性成分來評價配方顆粒與飲片湯劑的主要成分的等量性。參考廣東省地方標準DB 4409/T 06-2019[14]中野漆樹苷含量測定方法的流動相，在190～600 nm 范圍內(nèi)對野漆樹苷進行掃描，發(fā)現(xiàn)野漆樹苷在266 nm 和337 nm 處有最大吸收。對化橘紅供試品溶液進行分析，發(fā)現(xiàn)337 nm 下雜峰較多，266 nm 下基線較平穩(wěn)，所以選擇266 nm 作為野漆樹苷的測定波長。對比了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%冰醋酸溶液不同流動相，結(jié)果顯示野漆樹苷在乙腈-水中出峰比較快，與其他雜峰分離度欠佳，而在甲醇-水和甲醇-1%冰醋酸中，與其他雜峰的分離度能滿足要求，且甲醇-1%冰醋酸中的理論塔板數(shù)比甲醇-水中的高，故選甲醇-1%冰醋酸作為流動相，并對梯度進行優(yōu)化。比較了不同色譜柱[COSMOSIL C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL PAK C18MG（4.6 mm×250 mm，5 μm）]的色譜圖，結(jié)果顯示，3 種色譜柱的理論塔板數(shù)和分離度均能達到系統(tǒng)適用性要求，表明該方法耐用性良好。

氨水噴霧引咳小鼠試驗中，化橘紅飲片中、高劑量和化橘紅配方顆粒各劑量均能延長咳嗽潛伏期，化橘紅飲片各劑量和化橘紅配方顆粒中、高劑量能減少小鼠2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)；相同劑量的化橘紅配方顆粒與飲片湯劑對小鼠止咳潛伏期和咳嗽次數(shù)的作用均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

小鼠酚紅排泌實驗中，化橘紅配方顆粒中、高劑量與化橘紅飲片湯劑中劑量能促進酚紅排泌。但化橘紅飲片高劑量組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，可能與小鼠的個體差異有關。相同劑量的化橘紅配方顆粒與飲片湯劑對小鼠酚紅排泌量的作用差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

本研究結(jié)果表明，化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片湯劑在化學組分上相一致，其主要成分柚皮苷和野漆樹苷的含量均相當，化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片止咳祛痰作用效果相當，顯示化橘紅配方顆粒與化橘紅飲片湯劑具有化學等量性和藥效等效性。