李玉平，李海洋，姜珊珊，唐文超，陳瑞，楊長福，柯尊麗（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指排除酒精、肝炎病毒、藥物以及其他明確的肝損傷因素外，以肝實質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)堆積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合征[1]。隨著社會發(fā)展及人們生活方式的改變，我國NAFLD 平均患病率高達(dá)29.2%[2]，成為除慢性乙型肝炎外影響人們肝臟健康的最主要原因。NAFLD 被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的病理表現(xiàn)，但其肝外的并發(fā)癥狀同樣嚴(yán)重，是心腦血管疾病和慢性腎病的獨立危險因素[3-4]。然而目前臨床上缺乏有效的NAFLD 治療藥物。

二陳湯源于宋代《太平惠民和劑局方》，由半夏、陳皮、茯苓和甘草組成，本研究所用的加味二陳湯即在此基礎(chǔ)上加白術(shù)構(gòu)成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，半夏具有降血脂、抗炎的作用[5-6]；陳皮具有降低血脂及肝脂的作用[7]；茯苓可促進(jìn)肝再生速度和防止肝細(xì)胞壞死[8]；甘草中的總黃酮等成分具有降糖、降脂、抗氧化及保肝等作用[9-10]；白術(shù)具有促進(jìn)肝臟脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)、降血脂等作用[11-12]。多項臨床觀察[13-19]表明，二陳湯加減治療NAFLD 臨床療效顯著，患者的轉(zhuǎn)氨酶、血脂水平顯著降低，胰島素抵抗得到改善，但其具體作用機(jī)制尚未明確。故本研究擬基于SIRT1/AMPK/SREBP-1c 通路探討加味二陳湯對高脂膳食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)制，以期為其臨床治療NAFLD 提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料SPF 級健康C57BL/6 雄性小鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019- 0014，動物質(zhì)量合格證號：430726210100105236。高脂飼料（D12492）、正常飼料（D12450B），均購自美國Research Diets 公司。動物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究所動物房，室溫：（25±1）℃，相對濕度：50%～70%。本實驗獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號：20210014。

1.2 藥物及試劑半夏、陳皮、茯苓、甘草、白術(shù)藥材，均購自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)楊長福教授鑒定為正品。阿托伐他汀鈣片（批號：202007110B），浙江樂普制藥有限公司；總RNA 提取試劑（批號：20210918）、蛋白提取試劑盒（批號：20190719）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：20210219）、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（批號：20190314），均購自北京索萊寶科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：S01GA241）、cDNA 擴(kuò)增試劑盒（批號：S01FD261），均購自北京康潤誠業(yè)生物科技公司；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）鼠抗（批號：60303-1-Ig）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）鼠抗（批號：66536-1-Ig），均購自Proteintech 中國公司；甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）兔抗（批號：33w8520），美國Affinity 公司；β-actin 兔抗（批號：AA1217J1199ZJ1）、抗兔二抗（批號：AA122028）、抗鼠二抗（批號：AA88191），均購自南京巴傲德公司；總膽固醇（TC，批號：20220420）、甘油三酯（TG，批號：20220420）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT，批號：20210818）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT，批號：20210817）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C，批號：20210819）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C，批號：20210819）、超氧化物歧化酶（SOD，批號：20210803）、總谷胱甘肽（TGSH，批號：20210808）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；HE染液套裝（批號：G1003），武漢賽維爾生物科技公司。

1.3 主要設(shè)備ISKANMK3 型酶標(biāo)儀、CRYOSTAR NX50 型冰凍切片機(jī)，美國Thermo 科技公司；CFX 96 Touch qPCR 儀、Universal HoodⅡ型凝膠成像分析系統(tǒng)、10006938RevB 型蛋白凝膠電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Accu-Chek Active[Model GB]血糖儀，瑞士羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司；RM2016 型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；Eclipse E100 型正置光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司。

1.4 藥物制備將半夏、陳皮、茯苓、甘草、白術(shù)中藥飲片按3∶2∶3∶1∶3 的比例混合后打粉，分別加入10、8、8 倍質(zhì)量的水煎煮3 次，每次2 h，經(jīng)4 層紗布過濾后濃縮成1.2、2.4 g·mL-1生藥濃度；用生理鹽水將阿托伐他汀鈣片溶解成5 mg·mL-1溶液；將上述藥液分裝后-20 ℃保存，臨用當(dāng)天將藥液于4 ℃冰箱解凍，37 ℃預(yù)熱后使用。

1.5 分組、模型復(fù)制及給藥將40 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、阿托伐他汀組（0.05 g·kg-1）及加味二陳湯低、高劑量組（12、24 g·kg-1），稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量。正常組給予正常飼料自由取食，其余各組自由取食高脂飼料，連續(xù)飼養(yǎng)10 周復(fù)制NAFLD 小鼠模型。造模結(jié)束后，按10 mL·kg-1給藥體積給予阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠灌胃給藥，給予正常組、模型組生理鹽水灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥6 周。

1.6 血糖測量及標(biāo)本采集第16 周結(jié)束給藥前，小鼠禁食12 h 后測定空腹血糖值（t= 0 min）；然后腹腔注射1 g·kg-1葡萄糖溶液，分別于注射后15、30、60、90、120 min 測定小鼠血糖值。給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水過夜，用20%烏拉坦麻醉小鼠（0.01 mL·g-1），然后經(jīng)心臟取血，并收集小鼠肝臟組織；部分肝臟固定于4%多聚甲醛溶液，部分肝臟直接液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，備用；血液在室溫下靜置4 h 后，以3 000×g離心取血清，分裝后于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.7 小鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)及血液、肝臟生化指標(biāo)測定模型復(fù)制以及給藥期間，每周測定并記錄各組小鼠體質(zhì)量；采集標(biāo)本時，稱取并記錄小鼠肝臟質(zhì)量，計算：小鼠肝臟系數(shù)（%）=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%；檢測血清濃度是否超過線性范圍，如超過則用生理鹽水適當(dāng)稀釋后再測定；準(zhǔn)確稱取肝組織質(zhì)量（50 mg），按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入生理鹽水，4 ℃下勻漿90 s（60 Hz），以2 500 r·min-1離心（8 cm 離心半徑）10 min，取上清液待測。嚴(yán)格按照各試劑盒說明書步驟操作，分別檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、SOD、TGSH 及肝臟組織TC、TG 的含量或活性。

1.8 肝組織病理學(xué)觀察（1）取4%多聚甲醛溶液固定后的肝組織，采用常規(guī)方法石蠟包埋、切片（5 μm）、脫蠟、蘇木素-伊紅染色、中性樹膠封片。（2）取-80 ℃冰箱保存的肝組織，采用常規(guī)方法冰凍切片（8 μm）、復(fù)溫干燥、固定液固定、油紅O 染色、60%異丙醇分化、蘇木素染色、甘油明膠封片劑封片。將HE 及油紅O 染色后的肝組織切片在顯微鏡下觀察，拍照。

1.9 RT-qPCR 法檢測肝組織SIRT1、AMPK 及SREBP-1c mRNA 表達(dá)采用總RNA 提取試劑（TriQuick Reagent）提取肝臟組織總RNA，檢測RNA含量和純度（A260/A280=1.8～2.0）；采用StarScriptII cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒（含去基因組）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)；取平均閾值循環(huán)數(shù)作為每個樣本的Ct 值，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3 次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.10 Western Blot 法檢測肝組織中SIRT1、AMPK及SREBP-1c 蛋白表達(dá)取于-80 ℃保存的小鼠肝組織20 mg，加入RIPA 裂解液200 μL 進(jìn)行勻漿；以4 ℃、14 000×g離心5 min，采用BCA 蛋白定量法測定上清液的蛋白濃度；然后取適量樣品用PBS溶液稀釋成200 μL，加入5×蛋白上樣緩沖液50 μL，混勻后沸水煮5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〉攘康鞍走M(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜；室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入一抗SIRT1（1∶3 000）、AMPK（1∶3 000）、SREBP（1∶2 000）、β-actin（1∶6 000）單克隆抗體，搖床上緩慢搖1 h 后于4 ℃下過夜；次日于搖床上緩慢搖1 h 后，TBST洗滌5 次，再分別加入二抗（1∶6 000），室溫下于搖床上緩慢搖2 h；TBST 洗滌3 次，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光顯影；掃描蛋白條帶，采用ImageJ 軟件分析光密度（OD）值，并以β-actin 為內(nèi)參，對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加味二陳湯對NAFLD 小鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)的影響結(jié)果見圖1。造模結(jié)束后，與正常組比較，造模組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）。給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟系數(shù)顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，加味二陳湯可改善NAFLD 小鼠的體質(zhì)量及肝臟系數(shù)。

圖1 加味二陳湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟系數(shù)的影響（±s，n=8）Figure 1 Effects of modified Erchen Decoction on body mass，liver mass and liver coefficient of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.2 加味二陳湯對NAFLD 小鼠血脂的影響結(jié)果見圖2。與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG 及LDL-C 水平顯著升高（P＜0.001），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠血清TC、TG 及LDL-C水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），HDL-C 水平顯著升高（P＜0.001）。結(jié)果表明，加味二陳湯可改善NAFLD 小鼠的血脂水平。

圖2 加味二陳湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠血脂的影響 （±s，n=8）Figure 2 Effects of modified Erchen Decoction on blood lipid of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.3 加味二陳湯對NAFLD 小鼠肝脂及肝功能的影響結(jié)果見圖3。與正常組比較，模型組小鼠肝組織TC、TG 及血清ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠肝組織TC、TG 及血清ALT、AST 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，加味二陳湯可改善NAFLD 小鼠的肝脂水平及肝功能。

圖3 加味二陳湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脂及肝功能的影響（±s，n=8）Figure 3 Effects of modified Erchen Decoction on liver lipid and liver function of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.4 加味二陳湯對NAFLD 小鼠抗氧化水平及血糖耐受的影響結(jié)果見圖4。與正常組比較，模型組小鼠的血清SOD、TGSH 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.001），空腹及注射葡萄糖后（15、30、60、90、120 min）的血糖水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠的血清SOD、TGSH 水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），空腹及注射葡萄糖后（15、30、60、90、120 min）的血糖水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，加味二陳湯可改善NAFLD 小鼠抗氧化水平及血糖耐受。

圖4 加味二陳湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠抗氧化能力及血糖水平的影響（±s，n=8）Figure 4 Effects of modified Erchen Decoction on antioxidant and blood glucose levels of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.5 加味二陳湯對NAFLD 小鼠肝臟組織病理變化的影響結(jié)果見圖5。HE 染色發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肝組織細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈均勻紅色，未見有空泡；模型組小鼠肝組織細(xì)胞質(zhì)可見大量的空泡，說明16 周的高脂飼養(yǎng)導(dǎo)致了小鼠肝臟脂質(zhì)的大量堆積；阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠較模型組肝組織病理變化均有明顯的改善。油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肝細(xì)胞核呈藍(lán)色，肝細(xì)胞內(nèi)未見橘紅色脂滴，肝細(xì)胞間隙清晰；模型組小鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)大量紅染的脂滴，較多細(xì)胞內(nèi)脂滴融合變大；阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠較模型組肝組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)橘紅色脂滴顯著減少。結(jié)果表明，加味二陳湯對NAFLD 小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積有顯著改善作用。

圖5 各組小鼠的肝臟組織病理染色（HE、油紅O 染色，×200）Figure 5 Pathological staining of liver tissue of mice in each group（HE and oil red O staining，×200）

2.6 加味二陳湯對NAFLD 小鼠肝臟組織SIRT1、AMPK、SREBP-1c mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見圖6。與正常組比較，模型組小鼠肝組織SIRT1、AMPK mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），SREBP-1c mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠肝組織SIRT1、AMPK mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001），SREBP-1c mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）。

圖6 加味二陳湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟組織SIRT1、AMPK、SREBP-1c mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 6 Effects of modified Erchen Decoction on mRNA expressions of SIRT1，AMPK and SREBP-1c in liver tissue of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=3）

2.7 加味二陳湯對NAFLD 小鼠肝臟組織SIRT1、AMPK、SREBP-1c 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖7。與正常組比較，模型組小鼠肝臟SIRT1、AMPK 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），SREBP-1c 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）；與模型組比較，阿托伐他汀組及加味二陳湯低、高劑量組小鼠肝組織SIRT1、AMPK 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），SREBP-1c 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001）。

圖7 加味二陳湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟組織SIRT1、AMPK、SREBP-1c 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 7 Effects of modified Erchen Decoction on protein expressions of SIRT1，AMPK and SREBP-1C in liver tissue of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=3）

3 討論

中醫(yī)根據(jù)臨床癥狀，可將非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）歸屬于“積癥”“邪痛”“痰癥”“肥氣病”等范疇，病位主要在肝。飲食不節(jié)、情志失調(diào)、過度肥胖等多種因素均可誘發(fā)NAFLD[20-21]。恣食膏粱厚味，損傷脾胃，以致脾失健運(yùn)，不能正常輸布水液；水液代謝困難，濕濁結(jié)聚成痰，進(jìn)而導(dǎo)致痰濕郁阻肝絡(luò)，肝失疏泄，氣機(jī)失調(diào)；既不能促脾之健運(yùn)，亦不能促進(jìn)水液運(yùn)行，則進(jìn)一步加重痰濕。因此，治法宜祛痰化濕，輔以疏肝健脾。二陳湯具有燥濕化痰、理氣和中的功效，主治濕痰證。方中半夏燥濕化痰，和胃消痞；陳皮理氣燥濕，通氣消痰；茯苓健脾滲濕祛痰；甘草健脾和中。在二陳湯的基礎(chǔ)上加上健脾益氣、燥濕利水的白術(shù)，諸藥合用，共奏疏肝健脾、祛痰利濕、消積化瘀、降脂減肥之功效。

NAFLD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，越來越多學(xué)者支持NAFLD 發(fā)生發(fā)展過程的“多重打擊”機(jī)制[4]。“多重打擊”包括胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常及肝細(xì)胞脂肪變性、氧化應(yīng)激、炎癥的發(fā)生等，多重因素貫穿在NAFLD 的不同發(fā)病階段，促進(jìn)NAFLD 的發(fā)生發(fā)展。其中脂質(zhì)代謝異常及肝細(xì)胞脂肪變性是其最明顯的特征之一，如果鏡檢發(fā)現(xiàn)肝臟組織有超過5%的肝細(xì)胞脂肪變，即可診斷為NAFLD。正常情況下，肝臟攝取血液中的游離脂肪酸后，合成甘油三酯（TG），隨后以極低密度脂蛋白的形式將TG 轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟。肝細(xì)胞內(nèi)多余的脂肪酸主要是以脂滴的形式存在，同時還有一部分脂肪酸被氧化產(chǎn)生能量。但是，在某些病理條件下出現(xiàn)肝細(xì)胞合成TG 增加，或轉(zhuǎn)運(yùn)出TG 的能力減弱，以及脂肪酸氧化異常，肝細(xì)胞就會出現(xiàn)大量的脂滴積累，從而造成肝細(xì)胞脂肪變。因此，通過調(diào)節(jié)肝臟的脂質(zhì)代謝可以有效緩解NAFLD[22]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是一種尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的去乙?；福c基因轉(zhuǎn)錄沉默、脂質(zhì)積累等密切相關(guān)。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一類重要的蛋白激酶，能夠感知機(jī)體內(nèi)能量代謝的變化，激活后能增強(qiáng)胰島素的敏感性及脂肪合成等耗能過程，同時啟動脂肪酸氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，維持肝臟糖脂代謝的平衡[23-24]。SIRT1的過表達(dá)可以激活A(yù)MPK，進(jìn)而增加脂肪酸的氧化，減少葡萄糖的輸出，同時減少TC、TG 的合成[25-26]。研究[27-28]表明，提高SIRT1/AMPK 通路活性有助于減少脂質(zhì)堆積，改善肝臟脂肪變性。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）由三種同型異構(gòu)體包括SREBP-1a、SREBP-1c 及SREBP-2 組成，其中SREBP-1c 主要表達(dá)于肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，是控制脂肪鏈合成和肝臟脂質(zhì)生成的重要轉(zhuǎn)錄因子[29-30]。激活A(yù)MPK 能夠下調(diào)SREBP 的表達(dá)，進(jìn)而抑制參與脂肪生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，減少脂肪酸的合成和脂質(zhì)積累，改善肝臟脂肪病變[20]。因此，下調(diào)SREBP-1c 表達(dá)同樣可以減輕肝臟脂肪沉積。

本研究結(jié)果顯示，加味二陳湯可改善NAFLD 小鼠的體質(zhì)量、肝臟系數(shù)、血脂水平、肝脂水平及肝功能，提高抗氧化能力及血糖耐受，對NAFLD 小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積有顯著改善作用，并能上調(diào)NAFLD小鼠肝組織SIRT1、AMPK 表達(dá)，下調(diào)SREBP-1c 表達(dá)。綜上所述，加味二陳湯對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)代謝有顯著改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)控SIRT1/AMPK/SREBP-1c 通路有關(guān)。