潘思敏，黃夢芬，王春麗，張美玲，周若愚，王青，羅霞，周聯(lián)，侯江濤，陳斌 （.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 50405；.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 50006；.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃病科，廣東 廣州 50405）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，以腸黏膜的反復性炎癥、腫脹、潰瘍等為特征，臨床上多以血性腹瀉、腹痛、大便急迫為主要表現(xiàn)[1]。UC 炎癥病變部位累及直腸和乙狀結(jié)腸，從直腸黏膜開始，持續(xù)向結(jié)腸近端擴展，隨著病情不斷發(fā)展，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。UC 發(fā)病機制主要受遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應失調(diào)和環(huán)境等多因素影響[3]。目前對UC 的治療藥物主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等[4]，但存在長期使用療效欠佳及不良反應較多的問題。白頭翁湯源自張仲景的《傷寒論》，具有清熱解毒、祛濕、涼血止痢之功效，是清熱祛濕法的代表方劑。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多重藥理作用。臨床研究[7-8]也表明，白頭翁湯對活動性UC 有較好的治療作用。故本研究擬通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導建立UC 小鼠模型，觀察白頭翁湯對其免疫平衡及腸上皮損傷的影響，探討其治療UC 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物60 只雄性C57BL/6 小鼠，SPF 級，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。動物飼養(yǎng)環(huán)境濕度保持在55%±2%，12 h/12 h 晝夜循環(huán)。本動物實驗經(jīng)過廣州中醫(yī)藥大學中藥學院實驗動物倫理委員會審批，倫理編號：ZYD-2022-014。

1.2 藥品及試劑白頭翁湯組方：白頭翁15 g（批號：2105125）、黃連6 g（批號：H3622111）、黃柏12 g（批號：210501）、秦皮12 g（批號：20210422），均購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，藥材符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定；美沙拉秦緩釋顆粒（批號：210708），法國愛的發(fā)制藥有限公司。DSS（分子量：36 000～50 000，批號：S5148），購自美國MP Biomedical 公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：MM-0132M1）、白細胞介素1β（IL-1β，批號：MM-0040M1）、IL-6（批號：MM-0163M1）、γ 干擾素（IFN-γ，批號：MM-0182M1）、IL-17A（批號：MM-0759M1）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β，批號：MM-0689M1）檢測試劑盒，均購自中國江蘇酶免有限公司；一抗ZO-1（批號：21773-1-AP）、Occludin（批號：13409-1-AP）抗體，均購自美國Proteintech公司；Mouse-PE/cyanine7-anti-CD3 抗體（批號：100220）、Mouse- FITC- anti- CD4 抗體（批號：100509）、Mouse- APC- anti- CD25 抗體（批號：102011）、Mouse-APC-anti-IFN-γ 抗體（批號：505810）、Mouse- PE- anti- Foxp3 抗體（批號：126404）、Mouse-BV421-anti-IL-17A 抗體（批號：506926），均購自美國Biolegend 公司；FOXP3/ 轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液套件（批號：2313200），購自美國賽默飛公司。

1.3 主要儀器D3024R 微型高速冷凍離心機，美國Scilogex 公司；HT7800 型熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Multiskan FC 酶標儀、Excelsior AS 組織脫水機、HistoStar 組織包埋機、HM 340E 組織切片機，美國Thermo Scientific 公司；BD LSR Fortessa 流式細胞儀，美國BD 公司。

1.4 分組、模型復制及給藥將60 只小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為6 組：正常組、模型組、美沙拉秦組（500 mg·kg-1）及白頭翁湯低、中、高劑量組（5、10、15 g·kg-1），每組10 只。除了正常組外，其他各組小鼠均采用自由飲用3% DSS 溶液，連續(xù)7 d，誘導建立UC 小鼠模型；正常組小鼠給予正常飲用水。參考《實驗動物和動物實驗技術(shù)》[9]中動物給藥量計算方法設置給藥組劑量。各組小鼠造模同時按上述劑量灌胃給藥（20 mL·kg-1），每日1 次，連續(xù)給藥10 d；正常組、模型組小鼠給予等體積蒸餾水灌胃。

1.5 一般情況觀察實驗期間每天觀察小鼠狀態(tài)、活動和精神狀況，記錄小鼠體質(zhì)量變化。從造模第3 天開始收集小鼠糞便，觀察糞便性狀，檢測并記錄小鼠便血情況。進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分[10]，計算：DAI=（體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù)）/3，評分標準見表1。

表1 疾病活動指數(shù)評分標準Table 1 Disease activity index score

1.6 取樣實驗第11 天，按照動物倫理相關(guān)要求對小鼠施行安樂死后，解剖并小心剝離脾臟、胸腺組織，稱量并記錄其濕質(zhì)量，計算：脾臟（胸腺）指數(shù)=脾臟（胸腺）濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）× 10；分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)、結(jié)腸組織，并測量結(jié)腸長度；取小鼠遠端結(jié)腸約1 cm，用4%多聚甲醛溶液固定48 h。

1.7 小鼠結(jié)腸組織病理學觀察取固定后結(jié)腸組織進行脫水、石蠟包埋、組織切片后，分別進行HE 染色和阿爾新藍染色；在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織炎癥及隱窩增生等情況，并進行病理學評分[11]；分析杯狀細胞黏蛋白（阿爾新藍陽性細胞）的表達情況。

1.8 流式細胞術(shù)檢測小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟中輔助性T 細胞1（Th1）、輔助性T 細胞17（Th17）及調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）的細胞比例收集新鮮的小鼠腸系膜淋巴結(jié)和脾臟組織，機械研磨，脾臟另外加入紅細胞裂解液，制備得到細胞懸液；每管分別以106個細胞加入CD3（PE/CY7，每管1 μL），CD4（FITC，每管1 μL），CD25（APC，每管1 μL）抗體，另外準備陰性管和單染管，避光在室溫下孵育30 min；孵育結(jié)束后用PBS 洗滌2 次，加入固定破膜工作液（每管900 μL），避光破膜30 min；破膜完成后，用固定清洗液洗滌細胞2 次，然后每管分別加入IFN-γ（APC，每管3 μL）、IL-17A（BV421，每管1 μL）和Foxp3（PE，每管3 μL）抗體，室溫下避光孵育30 min；孵育完成后用PBS 洗滌2 次，加入300 μL PBS 重懸細胞，采用流式儀分析腸系膜淋巴結(jié)及脾臟組織中Th1、Th17、Treg 細胞占比。

1.9 ELISA 法檢測小鼠結(jié)腸組織中炎性細胞因子的表達取小鼠結(jié)腸組織適量，加入生理鹽水進行勻漿（60 Hz，120 s）后，以4 ℃、120 000×g離心10 min，收集勻漿上清；嚴格按照ELISA 試劑盒說明書步驟檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A、TGF-β 和IFN-γ 的含量。

1.10 免疫熒光法檢測結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達取結(jié)腸石蠟切片，經(jīng)過脫蠟后，把切片浸泡在枸櫞酸鈉抗原修復液內(nèi)，微波爐加熱煮沸，取出自然冷卻；滴加0.3% TritonTMX-100，放在濕盒內(nèi)透化30 min；然后用山羊血清封閉30 min，滴加山羊血清配制的一抗［ZO-1（1∶100）、Occludin（1∶100）］，置于濕盒內(nèi)于4 ℃冰箱過夜；次日經(jīng)洗滌后，滴加熒光二抗（1∶200），室溫下于濕盒內(nèi)孵育1 h；洗滌后加入30 μL DAPI，避光孵育10 min，最后用熒光顯微鏡觀察。

1.11 統(tǒng)計學處理方法使用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，應用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；符合正態(tài)分布與方差齊性的計量資料，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗，符合正態(tài)分布方差不齊的計量資料，則采用Dunnett’s T3檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白頭翁湯對UC 小鼠體質(zhì)量及DAI 評分的影響結(jié)果見圖1。與正常組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），DAI 評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，白頭翁湯低、中、高劑量組及美沙拉秦組小鼠的體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），DAI 評分顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，白頭翁湯可以改善DSS誘導的UC 小鼠的疾病癥狀。

圖1 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量及疾病活動指數(shù)（DAI）評分的影響（±s，n=6）Figure 1 Effects of Baitouweng Decoction on body mass and disease activity index（DAI）score in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.2 白頭翁湯對UC 小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及結(jié)腸長度的影響結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)顯著上升（P＜0.01），胸腺指數(shù)顯著下降（P＜0.01），結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.01）。與模型組比較，白頭翁湯低、中、高劑量組及美沙拉秦組小鼠脾臟指數(shù)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），胸腺指數(shù)顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)腸長度顯著延長（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及病理學評分的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of Baitouweng Decoction on colon length，thymus index，spleen index and pathological score in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

表2 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及病理學評分的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of Baitouweng Decoction on colon length，thymus index，spleen index and pathological score in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

病理學評分/分0.00±0.00 9.50±1.22**7.17±0.75##4.00±0.89##4.17±1.17##4.00±1.10##組別正常組模型組白頭翁湯低劑量組白頭翁湯中劑量組白頭翁湯高劑量組美沙拉秦組劑量/（g·kg-1）--5 10 15 0.5結(jié)腸長度/cm 8.20±0.25 5.47±0.23**6.00±0.41#7.20±0.23##7.27±0.33##6.35±0.38##胸腺指數(shù)23.62±0.83 8.92±2.24**15.41±4.17##18.42±2.89##13.92±1.62#14.66±4.27##脾臟指數(shù)28.81±1.59 44.04±2.59**38.43±2.83#28.58±1.66##28.81±2.01##37.48±3.76##

2.3 白頭翁湯對UC 小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響結(jié)果見表2、圖2。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯潰瘍，上皮細胞大量脫落，腺體排列紊亂，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，病理組織評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，白頭翁湯低、中、高劑量組及美沙拉秦組小鼠結(jié)腸上皮細胞和腺體排列較緊密，炎性細胞浸潤減少，病理組織評分顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，白頭翁湯能夠有效改善DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織的病理損傷。

圖2 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Figure 2 Effect of Baitouweng Decoction on the pathological injury of colon in colitis mice（HE staining，×200）

2.4 白頭翁湯對UC 小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟組織中Th1、Th17、Treg 細胞的影響結(jié)果見圖3、圖4。與正常組比較，模型組小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟組織中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-17A+Th17 細胞占比顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而CD25+FOXP3+Treg細胞占比顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，白頭翁湯低、中、高劑量組及美沙拉秦組小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟組織中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-17A+Th17 細胞占比顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），CD25+FOXP3+Treg 細胞占比顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，白頭翁湯可以在一定程度恢復UC 小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟組織中的T 細胞平衡。

圖3 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸系膜淋巴結(jié)組織T 細胞平衡的影響（±s，n=5）Figure 3Effect of Baitouweng Decoction on mesenteric lymph node T cell balance in ulcerative colitis mice（±s，n=5）

圖4 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠脾臟組織中T 細胞平衡的影響（±s，n=5）Figure 4 Effect of Baitouweng Decoction on spleen T cell balance in ulcerative colitis mice（±s，n=5）

2.5 白頭翁湯對UC 小鼠結(jié)腸組織中炎性因子水平的影響結(jié)果見圖5。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A 和IFN-γ 水平顯著升高（P＜0.01），TGF-β 水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，白頭翁湯給藥組小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A 和IFN-γ 水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），TGF-β 水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，白頭翁湯能夠抑制DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A 和IFN-γ 的分泌，增強抑炎因子TGF-β 的分泌。

圖5 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A、IFN-γ 及TGF-β 水平的影響（±s，n=6）Figure 5 Effects of Baitouweng Decoction on the levels of TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-17A，IFN-γ and TGF-β in the colon tissue of ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.6 白頭翁湯對UC 小鼠結(jié)腸組織上皮損傷的影響結(jié)果見圖6。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中的黏蛋白含量及緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，白頭翁湯及美沙拉秦組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細胞分泌的黏蛋白含量及緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 表達量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，白頭翁湯能夠改善DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織上皮損傷。

圖6 白頭翁湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織上皮損傷的影響（±s，n=3）Figure 6 Effect of Baitouweng Decoction on intestinal barrier in ulcerative colitis mice（±s，n=3）

3 討論

在本研究中，給予3% DSS 誘導后，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型小鼠體質(zhì)量減輕，出現(xiàn)腹瀉和直腸便血等癥狀，DAI 評分顯著升高，結(jié)腸長度明顯縮短；病理學觀察顯示，UC 小鼠結(jié)腸出現(xiàn)急性黏膜損傷，結(jié)腸組織黏膜層及黏膜下層受到炎性細胞浸潤，中性粒細胞聚集使得隱窩破壞[12-13]；此外，脾臟作為機體最重要的免疫器官，由于DSS 對機體免疫系統(tǒng)的影響，導致脾臟出現(xiàn)腫大，胸腺相對縮小[14-15]。給予白頭翁湯干預后，能夠明顯減緩UC 小鼠體質(zhì)量的減輕，降低DAI 評分，并改善結(jié)腸組織病理損傷，減少炎性細胞浸潤，胸腺及脾臟指數(shù)趨向正常。結(jié)果表明，白頭翁湯對UC 小鼠的癥狀、組織黏膜修復和機體免疫反應具有一定的治療作用。

在UC 患者腸道中，免疫細胞異常反應使正常的共生菌群和飲食抗原進入固有層，宿主固有免疫系統(tǒng)被激活后，抗原呈遞細胞（APC）誘導T0 細胞活化，導致CD4+T 細胞分化為Th1、Th17 細胞，產(chǎn)生更多促炎細胞因子，并使Treg 細胞分泌的抑炎因子減少[16-17]。Th 細胞功能的分化是APC 推動的，在APC 作用下產(chǎn)生IL-12 促使Th1 分化，Th1 細胞表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和IFN-γ，IFN-γ 作用于CD4+T 細胞，激活轉(zhuǎn)錄因子1（STAT1）信號，并與TCR 下游信號通路共同促進T-bet 的大量表達，形成正反饋，協(xié)同促進IFN-γ 的表達[18]。另外，IFN-γ 會刺激炎癥部位產(chǎn)生CCL3、CCL4、CCL5 等趨化因子，同時Th1表面也會表達CCR5、CXCR3 等趨化因子受體，與其配體結(jié)合后招募到炎癥部位發(fā)揮作用，最終導致Th1/Th2 失衡[19]。Th17 細胞由在TGF-β 和IL-6 刺激下的CD4+T 細胞分化，主要由視黃酸相關(guān)孤兒受體（RORγT）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下介導[20]。Th17 細胞產(chǎn)生促炎細胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-23 和IL-25等。IL-17 作為一個重要的促炎細胞因子，刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 等多種促炎因子分泌，此外IL-17 還能募集中性粒細胞釋放和破壞腸上皮屏障，誘導腸道的炎癥反應[21]。Treg 細胞通過分泌抗炎細胞因子IL-10 和TGF-β 維持腸道穩(wěn)態(tài)。TGF-β作為CD4+T 細胞分化Treg 和Th17 細胞的必要條件，在促炎因子IL-6 的作用下，可以促進T 細胞向Th17 細胞分化，在缺乏IL-6 的情況下，T 細胞則會優(yōu)先促進Treg 細胞的分化[22]。本研究結(jié)果表明，白頭翁湯可以促進Treg 細胞的分化，并抑制Th1、Th17 細胞的分化，恢復UC 小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟組織中的T 細胞平衡。

TGF-β 作為一種抗炎細胞因子，可以通過調(diào)節(jié)免疫反應抑制疾病的發(fā)展，促進腸上皮修復[23]。IL-6是一種參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥的多效性細胞因子，可以促進Th1、Th2 和Th17 細胞分化，并誘導T 細胞亞群產(chǎn)生更多的促炎因子[24]，此外IL-6 還可以通過激活結(jié)腸上皮細胞信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），損傷腸黏膜屏障，加劇炎癥的發(fā)展[25]。本研究顯示，IL-6 的表達與Th17 細胞的趨勢一致，Treg 相關(guān)細胞因子TGF-β 與Treg 細胞的趨勢一致，與課題組前期實驗[26-27]結(jié)果相符合。在UC 的發(fā)病過程中，TNF-α、IL-1β 是常見的促炎細胞因子，TNF-α 主要作用于腸壁，通過誘導上皮細胞凋亡和改變緊密連接功能來損害腸屏障[28]；IL-1β 在腸道中能夠吸引中性粒細胞，引起炎癥介質(zhì)的釋放[29]。在本研究中，白頭翁湯能夠通過抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ 的分泌，促進抑炎細胞因子TGF-β 表達來發(fā)揮其對UC 的抗炎作用。

研究[30-31]發(fā)現(xiàn)，腸道抗原持續(xù)異常激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生大量炎性細胞因子、炎癥介質(zhì)等通過損傷腸上皮細胞，誘導上皮細胞凋亡，進而影響上皮細胞間的緊密連接蛋白表達及分布，破壞上皮細胞間緊密連接，同時還能抑制黏蛋白的產(chǎn)生，破壞上皮細胞表面的黏液層，最終導致腸道黏膜屏障受損。腸上皮屏障主要由緊密連接、黏附連接、橋粒和縫隙連接組成，尤其是緊密連接最為重要[32]。緊密連接通過緊密連接蛋白（Occludin、Claudins、ZO）連接腸上皮細胞，可以阻止腸道內(nèi)毒素和病原微生物進入腸腔，并調(diào)節(jié)細胞間通透性[33]。杯狀細胞分泌的黏蛋白作為腸道黏膜屏障的重要防御線，可以防止腸道微生物直接作用于腸上皮細胞[34]。本研究顯示，白頭翁湯能夠促進UC 小鼠腸道中ZO-1、Occludin 蛋白表達，增加黏蛋白分泌，促進腸上皮結(jié)構(gòu)在很大程度上得到恢復。

綜上所述，白頭翁湯能夠有效改善DSS 誘導的UC 小鼠的癥狀，可能是通過調(diào)節(jié)T 淋巴細胞平衡，增加抑炎因子的分泌，降低促炎因子的表達，從而減輕腸上皮損傷。然而，白頭翁湯影響T 細胞分化的具體機制尚不明確，仍需要通過進一步的實驗深入研究。