趙愛玲,姚 冬

0 引 言

氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)是氣道的重要組成部分,是氣道病理生理學(xué)的主要決定因素,其生理紊亂與多種肺部疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),尤其在氣道高反應(yīng)性和氣道重塑中[1-4]。近年來氣道平滑肌已成為哮喘、慢性阻塞性肺病等疾病發(fā)病機(jī)制研究中的熱點(diǎn),ASMCs的體外培養(yǎng)為這些機(jī)制研究提供了一個(gè)有效的平臺(tái)[5-8]。小鼠經(jīng)常被用來建立哮喘和慢性阻塞性肺疾病模型,因此,如何在短期內(nèi)獲得高純度、高活力的小鼠ASMCs并穩(wěn)定傳代,具有重要意義。目前文獻(xiàn)所報(bào)道的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法一般為酶消化法和單純組織塊貼壁法[10-13]。酶消化法獲取細(xì)胞速度快,但獲得細(xì)胞數(shù)量少,難以控制消化時(shí)間,易損傷細(xì)胞活力;單純組織塊貼壁法方法簡(jiǎn)單,但培養(yǎng)周期長(zhǎng),極大地限制小鼠ASMCs的體外應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將兩者綜合改進(jìn),采用組織塊消化后貼壁法進(jìn)行ASMCs的原代培養(yǎng),在體外建立了穩(wěn)定傳代的小鼠ASMCs增殖模型,并與酶消化法和單純組織塊貼壁法進(jìn)行比較,探討改良組織塊貼壁法培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康清潔C57BL/6J野生小鼠15只,5～8周齡,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南。小鼠分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房的獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具內(nèi),飼養(yǎng)室按照正常生物光照循環(huán),溫度控制在18～22 ℃,濕度控制在50%～60%,保持溫度和濕度相對(duì)穩(wěn)定,籠內(nèi)墊料保持干燥清潔,飲用消毒滅菌處理后的水。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用隨機(jī)分組法將小鼠分為3組,每組5只。

1.2試劑和儀器DMEM高糖培養(yǎng)基、HBSS液、DPBS液、青鏈霉素、兩性霉素B 、0.25 %胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購(gòu)自以色列BI公司;I型膠原酶購(gòu)自加拿大Stemcell公司;彈性蛋白酶、DAPI、鼠源單克隆α-SMA-Cy3、α-SMA-FITC、Vimentin-Cy3特異性抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;Cell Counting Kit(CCK8)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;體式顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司;離心機(jī)為Eppendorf 5910 R高速冷凍離心機(jī)。

1.3原代培養(yǎng)頸椎脫臼法處死小鼠,將小鼠浸潤(rùn)到75%乙醇中消毒1 min(勿浸口鼻),酒精棉球擦拭消毒小鼠未浸潤(rùn)部分,無菌器械從腹部至頸部依次剪開皮膚和肌肉,腹主動(dòng)脈放血后再剪開胸腔,取出帶有氣管的肺部。將組織轉(zhuǎn)移入預(yù)冷HBSS液中,在體式顯微鏡下使用無菌顯微鑷將支氣管表面的結(jié)締組織小心剝離,縱向剖開氣管,剪去無平滑肌組織的氣管軟骨環(huán),僅保留富含平滑肌細(xì)胞的組織,最后用無菌棉簽輕輕擦拭平滑肌條內(nèi)壁2～3次。將處理好的組織轉(zhuǎn)移入生物安全柜,用預(yù)冷HBSS液清洗3次。為了較為準(zhǔn)確地分析3種分離方法獲得ASMCs的速度,我們共計(jì)分離了15只小鼠的肺部平滑肌組織,隨機(jī)平均分為3份后,再進(jìn)行以下不同方法的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.3.1酶消化法將處理好的平滑肌條收集在24孔板單孔內(nèi),加入1 mL的I型膠原酶(1 mg/mL)和彈性蛋白酶(3.3 U/mL),放入37 ℃培養(yǎng)箱消化30 min后,再放入HBSS液中清洗1次,轉(zhuǎn)移入單個(gè)24孔板,眼科剪剪碎平滑肌條(0.5～1 mm3),再加入1.5 mL的I型膠原酶(1 mg/mL)和彈性蛋白酶(15 U/mL),放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化2.5 h后,用5 mL槍頭輕柔吹打2 min,將組織分散為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊,用70 μm無菌細(xì)胞濾網(wǎng)過濾到15 mL離心管中,100×g離心5 min后棄上清,加4 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸,接種于T12.5細(xì)胞培養(yǎng)瓶,在含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),第4天換液,以后每隔3天更換一次培養(yǎng)液。

1.3.2單純組織塊貼壁法將清洗過的平滑肌條收集到6孔板內(nèi),眼科剪剪碎組織塊,體積約為1 mm3。用100 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸組織塊并轉(zhuǎn)移到T12.5細(xì)胞培養(yǎng)瓶,使用1 mL槍頭將組織塊涂抹均勻于培養(yǎng)瓶底面,將培養(yǎng)瓶底面翻轉(zhuǎn)向上后加入4 mL的含20 %FBS的DMEM培養(yǎng)液,保持培養(yǎng)瓶底面向上,于37oC培養(yǎng)箱靜置3 h后,翻轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液沒過組織,在細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),第3天換液。

1.3.3改良組織塊貼壁法將處理過的平滑肌條收集于24孔板單孔內(nèi),加入1 mL 37 ℃預(yù)溫過的I型膠原酶(2 mg/mL),在37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 min,將平滑肌條轉(zhuǎn)移到含有20 % FBS的DMEM培養(yǎng)液中終止消化,然后再次將平滑肌條收集到6孔板內(nèi)。余下步驟與單純組織塊貼壁法相同。

1.4傳代培養(yǎng)待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)可進(jìn)行傳代。先吸棄培養(yǎng)液,用DPBS液清洗2次,加入含0.05% EDTA的0.25%胰蛋白酶,輕晃培養(yǎng)瓶使其分布均勻,停留10 s后吸棄,在37 ℃培養(yǎng)箱放置3 min,此時(shí)鏡下可觀察到細(xì)胞回縮變圓,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化,輕柔吹打細(xì)胞使其脫落,形成的單細(xì)胞懸液按1∶2或1∶3接種傳代。P1代的細(xì)胞接種密度可為1.0 × 104個(gè)細(xì)胞/cm2。

1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),取10 μL細(xì)胞懸液與10 μL 0.2%臺(tái)盼藍(lán),吹打混勻后移至細(xì)胞計(jì)數(shù)板,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算時(shí)取平均數(shù)?；罴?xì)胞不被臺(tái)盼藍(lán)染色,而死細(xì)胞則被染成藍(lán)色,儀器會(huì)自動(dòng)測(cè)量死活細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞密度。公式如下:

細(xì)胞總數(shù) = 細(xì)胞密度 × 細(xì)胞懸液總體積

1.6細(xì)胞純化成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間較平滑肌細(xì)胞短,這一特性常用來去除成纖維細(xì)胞。具體操作:如前所述消化細(xì)胞,并將其制成單細(xì)胞懸液。在6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)加入4 mL細(xì)胞懸液,37 ℃絕對(duì)靜置15 min,此時(shí)顯微鏡下可觀察到部分細(xì)胞貼壁,輕輕吸取未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新皿內(nèi),再次靜置15 min,即得到純度較高的平滑肌細(xì)胞。若細(xì)胞數(shù)量足夠多或希望進(jìn)一步提高細(xì)胞純度,可首次差速貼壁30 min,再差速貼壁15 min。

1.7細(xì)胞免疫熒光技術(shù)為了比較原代ASMCs的純度,我們將酶消化法、單純組織塊貼壁法和改良組織塊貼壁法獲得的P1代平滑肌細(xì)胞接種于24孔板細(xì)胞爬片上,待ASMCs融合至60%～80%時(shí)進(jìn)行α-SMA-Cy3直標(biāo)抗體染色。ASMCs具有正常的α-SMA陽(yáng)性表達(dá),可見肌動(dòng)蛋白呈紅色條束,細(xì)胞核用DAPI染色后呈藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(紅色熒光標(biāo)記)和總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)染DAPI細(xì)胞核數(shù)量),統(tǒng)計(jì)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞比率,即為原代ASMCs的純度。為了判斷ASMCs培養(yǎng)后期性狀是否會(huì)發(fā)生改變,我們應(yīng)用α-SMA-FITC(綠色熒光)和Vimentin-Cy3(紅色熒光)直標(biāo)一抗對(duì)改良組織塊貼壁法獲得的P1代和P5代ASMCs進(jìn)行免疫熒光共染色。α-SMA抗體染色陽(yáng)性且Vimentin抗體染色陽(yáng)性的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞,α-SMA抗體染色陰性但Vimentin抗體染色陽(yáng)性的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。具體步驟:吸棄舊培養(yǎng)液,PBS洗滌1次;加入4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS靜置洗滌5 min × 3次;加入0.2% Triton-X-100室溫通透15 min,PBS靜置洗滌5 min × 3次;加入5% BSA室溫封閉1 h,傾去后用PBS洗滌1次;加入直標(biāo)一抗(α-SMA-Cy31∶600、α-SMA-FITC 1∶400、Vimentin-Cy31∶500),4 ℃避光孵育過夜;0.1% Triton-X-100洗滌5 min × 3次;加入的1∶5000 DAPI室溫避光孵育5 min,PBS靜置洗滌5 min × 3次,封片后在正置熒光顯微鏡下觀察并拍片。平滑肌細(xì)胞純度公式計(jì)算如下:

平滑肌細(xì)胞純度(%)=α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI核染細(xì)胞總數(shù) × 100%

1.8CCK8實(shí)驗(yàn)待3種原代培養(yǎng)方法產(chǎn)生的細(xì)胞發(fā)生克隆抑制后進(jìn)行首次傳代,將ASMCs差速貼壁純化得到P1代細(xì)胞,通過CCK8實(shí)驗(yàn)比較3種方法獲得的ASMCs的增殖速度。在96孔板內(nèi)培養(yǎng)小鼠ASMCs,培養(yǎng)密度為5 × 103個(gè)細(xì)胞/孔,做3個(gè)重復(fù)孔。每隔24 h檢測(cè)1次。吸棄舊培養(yǎng)液,每孔加入100 μL含10% CCK8的細(xì)胞培養(yǎng)液,孵育2 h后在450 nm吸光度下測(cè)量A值。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況酶消化法第1天僅有少量細(xì)胞貼壁伸展,第4天絕大多數(shù)細(xì)胞貼壁完成,一般需要7～10 d長(zhǎng)滿。單純組織塊貼壁法的組織塊在第1天基本無細(xì)胞游離出,培養(yǎng)第4天時(shí),大部分組織塊周圍游離出貼壁細(xì)胞,但較稀少,并且仍有部分組織塊未游離出貼壁細(xì)胞。改良組織塊貼壁法在第1天即可觀察到細(xì)胞從組織塊邊緣游離出來貼壁生長(zhǎng),培養(yǎng)第4天時(shí)可見組織塊周圍游離出大量細(xì)胞并發(fā)生克隆抑制,此時(shí)可進(jìn)行首次傳代。原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)不一,單個(gè)平滑肌細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形,可見到多個(gè)圓形細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)豐富。顯微鏡下觀察改良組織塊貼壁法培養(yǎng)第4天的細(xì)胞,可見細(xì)胞融合后,部分區(qū)域細(xì)胞呈束狀排列,相互穿插,起伏狀生長(zhǎng)呈現(xiàn)出典型“峰谷”狀現(xiàn)象。見圖 1。

圖 1 原代培養(yǎng)ASMCs的形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Morphological observation of primary cultured ASMCs

2.2ASMCs純度鑒定結(jié)果顯示,相比單純組織塊貼壁法,改良組織塊貼壁法獲得的原代平滑肌細(xì)胞的純度更高[(93.0%±1.8%)vs(96.1%±1.8%),P<0.01],酶消化法獲得的平滑肌細(xì)胞的純度(90.8%±1.9%)最低,與改良組織塊貼壁法相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。結(jié)果還顯示P5代細(xì)胞與P1代細(xì)胞相比,平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)較前改變,呈不規(guī)則形,且α-SMA陽(yáng)性表達(dá)減弱,Vimentin陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng),標(biāo)志著平滑肌細(xì)胞的純度會(huì)隨傳代次數(shù)增加而逐漸降低。見圖 2。

a:3種培養(yǎng)方法得到的ASMCs的免疫熒光鑒定(×200); b:改良組織塊貼壁法P1代和P5代ASMCs的免疫熒光染色(×200),黃色箭頭所指為成纖維細(xì)胞圖 2 ASMCs純度的比較Figure 2 Comparison the purity of ASMCs

2.3原代培養(yǎng)ASMCs增殖比較結(jié)果顯示酶消化法獲得的ASMCs的增殖速度較單純組織塊貼壁法和改良組織塊貼壁法獲得的ASMCs的增殖速度慢(P< 0.01),而單純組織塊貼壁法和改良組織塊貼壁法獲得的細(xì)胞的增殖速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖 3。

*P<0.01圖 3 ASMCs增殖速度的比較Figure 3 Comparison the proliferation rate of ASMCs

3 討 論

原代氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)是在分子水平研究呼吸道疾病發(fā)病機(jī)制和治療手段的主要體外細(xì)胞模型,因此,如何簡(jiǎn)單快捷地分離到足夠數(shù)量的高純度和高活力的原代氣道平滑肌細(xì)胞至關(guān)重要。

與大鼠相比,小鼠肺部氣道細(xì)小,極易撕扯破裂,二級(jí)支氣管以下較難剝離干凈,如何分離到較完整的氣道平滑肌組織獲得較純的ASMCs是小鼠原代ASMCs培養(yǎng)的難點(diǎn),故此我們首先優(yōu)化了取材方法,只取小鼠二級(jí)支氣管以上部位,并在顯微鏡下輕柔剝離支氣管上的結(jié)締組織;剪去無平滑肌組織的氣管軟骨環(huán)部分,僅保留富含平滑肌組織的后壁,減少成纖維細(xì)胞爬出的概率,進(jìn)一步提高分離出的ASMCs的純度;無菌棉簽輕柔擦拭平滑肌條內(nèi)壁2～3次,減少上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的爬出,減小因?yàn)槭褂描囎雍褪中g(shù)刀片等其他工具而損傷到平滑肌細(xì)胞的可能性。體式顯微鏡下進(jìn)行這些操作可以避免撕破氣道平滑肌組織,最大程度保證其完整性。

從獲取平滑肌細(xì)胞的速度來看,酶消化法獲取細(xì)胞速度最快,但成本高,操作復(fù)雜,獲得細(xì)胞數(shù)量較少,細(xì)胞中心融合需7 ～ 10 d左右,方能進(jìn)行首次傳代。相比于酶消化法,單純組織塊貼壁法操作簡(jiǎn)單,可以較為穩(wěn)定的獲得原代ASMCs,但是組織塊游離出細(xì)胞的快慢程度不一,培養(yǎng)周期長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)中單純組織塊貼壁法的首次傳代時(shí)間一般為5 ～ 7 d左右。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)摸索,我們優(yōu)化了組織塊的處理,在單純組織塊貼壁法的基礎(chǔ)上,使用2 mg/mL的I型膠原酶預(yù)先處理組織后再貼壁,因?yàn)镮型膠原酶消化作用較為溫和,是唯一一種可以降解廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)的膠原纖維的蛋白酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)I型膠原酶處理過的組織變得疏松伸展,細(xì)胞從組織塊邊緣游離出的阻力減小,細(xì)胞游離貼壁的速度加快,在實(shí)驗(yàn)次日即可觀察到有細(xì)胞從組織塊邊緣游離出,并且經(jīng)I型膠原酶處理過的組織塊的出膜率也高于單純貼壁的組織塊,一般在培養(yǎng)的第4天即可進(jìn)行首次傳代,綜上所述,相比酶消化法和單純組織塊貼壁法,改良組織塊貼壁法可以在更短的時(shí)間內(nèi)獲得更多的原代ASMCs。

從獲取細(xì)胞的純度來看,酶消化法所得細(xì)胞的純度最低,原因可能是酶消化了整個(gè)組織塊的所有細(xì)胞,包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及其他雜細(xì)胞,這些細(xì)胞在初始貼壁后便開始克隆生長(zhǎng),平滑肌細(xì)胞后期難以利用傳代增殖優(yōu)勢(shì)抑制雜細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),貼壁法的組織塊在培養(yǎng)第四天開始游離出上皮細(xì)胞。為防止大量上皮細(xì)胞混雜,降低平滑肌細(xì)胞的純度,此時(shí)應(yīng)盡快進(jìn)行首次傳代。而改良法中的組織塊可在短期內(nèi)游離出大量平滑肌細(xì)胞,在培養(yǎng)第四天組織塊外緣細(xì)胞就發(fā)生了克隆抑制,可進(jìn)行首次傳代,這保證了ASMCs的傳代增殖優(yōu)勢(shì),可有效提高ASMCs的純度。

從獲得的細(xì)胞的質(zhì)量來看,通過CCK8實(shí)驗(yàn)比較3種方法獲得的P1代原代氣道平滑肌細(xì)胞的增殖速度,結(jié)果顯示相比于單純組織塊貼壁法和改良組織塊貼壁法獲得的ASMCs,酶消化法獲得的ASMCs的增殖速度較慢。這可能與消化酶的濃度大小與消化時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān),時(shí)間過短不能完全消化組織,但時(shí)間過長(zhǎng)又容易損傷細(xì)胞活力。小鼠氣道平滑肌組織少而珍貴,酶消化法的各種不確定性使得它不宜成為小鼠平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的首選方法。

ASMCs有兩種表型,包括收縮表型與合成表型[14]。收縮表型標(biāo)志物包括α-SMA(α平滑肌肌動(dòng)蛋白),合成表型標(biāo)志物包括Vimentin(波形蛋白),Vimentin同時(shí)也是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物[15-16]。原代ASMCs通常是收縮表型,但由于其具有表型可塑性,細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會(huì)從收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?同時(shí)α-SMA的表達(dá)減少,Vimentin的表達(dá)增加[17]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以發(fā)現(xiàn),隨著傳代次數(shù)的增加,原代ASMCs性狀會(huì)發(fā)生改變,部分收縮型ASMCs逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚虯SMCs,并且成纖維細(xì)胞增多,平滑肌細(xì)胞純度降低。為避免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們建議選用形態(tài)和功能保持穩(wěn)定的P5代之前的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)。

本培養(yǎng)方法需要注意的其他事項(xiàng)還有:本實(shí)驗(yàn)為開放式取材,實(shí)驗(yàn)過程中所用HBSS液需含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL的鏈霉素,細(xì)胞培養(yǎng)液需含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL的鏈霉素和0.25 μg/mL的兩性霉素B,傳代后可使用不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液;組織塊貼壁后要防止組織塊漂浮,應(yīng)絕對(duì)靜置兩天;組織塊會(huì)產(chǎn)生代謝廢物,在組織塊貼壁后的第3天必須換液;消化細(xì)胞時(shí),若吹打后仍有部分細(xì)胞不離壁,可輕拍瓶身幫助細(xì)胞脫落,切勿多次吹打細(xì)胞,會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷原代細(xì)胞活力;原代細(xì)胞脆弱且珍貴,傳代時(shí)非必要不離心,即簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟又可避免細(xì)胞的損傷和損失;使用P3或P4代細(xì)胞時(shí)可差速貼壁20 min,進(jìn)一步純化細(xì)胞后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述,改良組織塊貼壁法成本較低、操作簡(jiǎn)便且耗時(shí)較短,不僅提高了ASMCs的純度還保證了ASMCs的數(shù)量和質(zhì)量,可為研究人員提供可靠的細(xì)胞來源,為今后氣道疾病的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)提供了理想的體外培養(yǎng)模型。