賀海林 陳劍虹 官志揚 鐘澤艷 鐘國興 陳迪娜 劉彥慧

地中海貧血（以下簡稱地貧），是一組常染色體隱性遺傳病，全球地貧基因攜帶率約為1%～5%［1］。廣東為地貧高發(fā)地區(qū)，流行病學調(diào)查獲得的數(shù)據(jù)，可用于評估和預測育齡人群中的地貧高風險人數(shù)，并為進一步制定地貧防控策略提供依據(jù)［2］。近年來，有不少地市級別的大樣本地貧分子流行病學調(diào)查的相關(guān)報道［3-8］，但鮮見惠州市同等質(zhì)量的相關(guān)研究［9-13］。本研究擬在大樣本育齡人群中對惠州市地中海貧血分子流行病學進行一次全面調(diào)查，以獲取本地區(qū)詳實、準確的常見地貧基因突變譜資料，探討惠州市地貧基因突變譜特征，為該地區(qū)地貧防控策略提供可靠數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2017 年1 月至2021 年12 月標本，地域涉及惠城區(qū)、惠陽區(qū)、惠東縣、博羅縣、龍門縣（兩區(qū)三縣）送檢地貧基因檢測的外周靜脈血樣本共40 876 例進行分析，調(diào)查對象年齡分布18～45 歲，至少一方為惠州戶籍人口。本研究獲得惠州市第一婦幼保健院倫理委員會批準，所有受檢者均已簽署知情同意書。

1.2 標本采集

受檢者進行血常規(guī)或血紅蛋白電泳時抽取靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉或EDTA-K2抗凝，4～8℃冷藏保存、送檢。

1.3 調(diào)查方法

1.3.1 地中海貧血篩查方法

采用全自動血細胞分析儀檢測紅細胞參數(shù)：紅細胞平均體積（Mean Corpuscular Volume，MCV）、紅細胞平均血紅蛋白含量（Mean Corpuscular Hemoglobin，MCH）。初篩血液學陽性標準為：MCV＜82.0 fL 或（和）MCH＜27.0 pg。采用全自動毛細管電泳儀檢測血紅蛋白A（Hemoglobin A，HbA）、血紅蛋白A2（HbA2）、血紅蛋白F（HbF）及異常血紅蛋白。血紅蛋白電泳分別以HbA2＜2.5%或（和）出現(xiàn)異常血紅蛋白帶（HbH、Hb Bart's）判定為α 地貧表型陽性，HbA2＞3.5%或（和）出現(xiàn)異常血紅蛋白帶（HbE、HbF＞5%）判定為β-地貧表型陽性。樣本血液學或血紅蛋白電泳任一結(jié)果為陽性，即判定為地貧初篩陽性。

夫婦雙方有任一方被判定為地貧初篩陽性，則該對夫婦兩人樣本均需進一步行地貧基因檢測。

1.3.2 地中海貧血診斷

1.3.2.1 外周血基因提取 外周血樣本用Lab-Aid 820 全自動核酸提取儀（廈門致善生物科技股份有限公司）提取，提取方法按儀器配套提取試劑盒操作說明書進行。

1.3.2.2 地貧基因檢測 采用裂隙聚合酶鏈反應（gap polymerase chain reaction，Gap-PCR）和反向斑點雜交法（PCR-reverse dot blot，PCR-RDB）方法診斷中國人常見的7 種α-地貧基因，包括—SEA/、--THAI/、-α3.7/、-α4.2/、αCSα/、αQSα/和αWSα，以及17 種β-地貧突變基因，檢測方法按試劑盒操作說明書進行。

1.3.2.3 檢測質(zhì)量控制 每次檢測均同時進行空白對照和陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和圖表分析采用開源統(tǒng)計軟件Jamovi v.2.2.5（https：//www.jamovi.org）和Microsoft Excel 2016 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 地貧檢出結(jié)果

共計139 859 對育齡夫婦（279 718 例）參加地貧初篩，經(jīng)初篩檢出地貧可疑陽性40 876 例，初篩陽性率14.61%。40 876 例初篩陽性受檢者中29 209 例基因確診為地貧，地貧基因總體攜帶率為10.44%。其中α-地貧19 315 例（6.91%），--SEA/αα 為惠州最常見的α-地貧基因類型；β-地貧8 454 例（3.02%），βCD41-42/βN為惠州最常見的β-地貧基因類型；α+β-復合型地貧1 440 例（0.51%），--SEA/αα βCD41-42/βN為惠州最常見的α+β-復合型地貧基因類型。惠州市α-和β-地貧基因譜前15種地貧基因頻率及占比詳情見表1?；葜菔笑?和β-地貧常見基因突變譜總體特征為，少數(shù)基因占據(jù)基因突變類型的絕大部分，即呈嚴重的偏態(tài)分布。見圖1。

圖1 廣東省惠州市α-地貧、β-地貧及α+β-復合型地貧基因突變基因譜Top15 占比與累積比Figure 1 Separately and Cumulative frequency as a top-Fifteen list of molecular spectrum of persons with α-，β-and α+β-thal in Huizhou City，Guangdong Province

表1 廣東省惠州市α-地貧、β-地貧及α+β-復合型常見地貧基因突變譜Top15 占比與累積比Table 1 Separately and Cumulativefrequency as a top-Fifteen list of molecular spectrum of persons with α-thal,β-thal and α+β-thal in Huizhou City,Guangdong Province

2.3 惠州市與廣東省其他地貧高發(fā)地區(qū)常見基因突變類型基因譜比較

經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，惠州地區(qū)與其他地貧高發(fā)地區(qū)α-地貧基因譜數(shù)據(jù)相似，β-地貧基因譜數(shù)據(jù)各異。見表2?；葜菔笑?地貧常見基因突變構(gòu)成百分比，從總體構(gòu)成及各自占比上均呈現(xiàn)出一致性特征?；葜菔笑?地貧常見基因突變構(gòu)成百分比，從總體構(gòu)成及各自占比上均呈現(xiàn)出各自的區(qū)域性特征。見圖2～3。

圖2 惠州地區(qū)與廣東省其他八個地貧高發(fā)地區(qū)α-地貧常見基因突變構(gòu)成百分比堆積條形圖Figure 2 100%Stacked Column chart of compare with separately frequency of molecular spectrum of α-thal with Huizhou and other eight regions in Guangdong province

圖3 惠州地區(qū)與廣東省其他八個地貧高發(fā)地區(qū)β-地貧常見基因突變構(gòu)成百分比堆積條形圖Figure 3 100%Stacked Column chart of compare with separately frequency of molecular spectrum of β-thal with Huizhou and other eight regions in Guangdong province

表2 惠州地區(qū)與廣東省其他地貧高發(fā)地區(qū)α-和β-地貧常見基因突變類型基因譜對比Table 2 Compare with separately frequency of molecular spectrum of α-and β-thal with Huizhou and eight other regions in Guangdong province

3 討論

本研究顯示，惠州市育齡人群地貧攜帶率較既往研究的廣東省平均水平為高［1］，這或與育齡人群在政策支持下，得以廣泛篩查并逐級轉(zhuǎn)診，基因檢測得以有效施行有關(guān)。

惠州市α-和β-地貧常見基因突變譜特征：少數(shù)基因占據(jù)基因突變類型的絕大部分，呈嚴重偏態(tài)分布，這與國外已有研究結(jié)果相合［21］。與省內(nèi)其他八個地貧高發(fā)地區(qū)數(shù)據(jù)相似。該特征決定了當前地貧防控工作的主要內(nèi)容仍以這些少數(shù)、但占比高的地貧基因突變類型為主。

本次研究還發(fā)現(xiàn)：在包括惠州在內(nèi)的省內(nèi)九個地貧高發(fā)地區(qū)，α-地貧基因突變譜在構(gòu)成及占比上呈一致性特征，而β-地貧基因突變譜則各具特點。這一特點既由α-和β-地貧基因突變譜的內(nèi)在特征決定，也與當下“移民”潮相關(guān)。多數(shù)β-地貧基因突變屬于點突變［22］，已知β-地貧基因突變類型逾200 余種［23］；廣東省為“移民”大省，地貧基因突變譜上述特征的成因可能由于：α-地貧自身常見突變基因數(shù)較少，突變譜偏態(tài)分布程度更高，外省移民流入帶來的稀釋及混雜效應不足以改變現(xiàn)有α-地貧基因突變譜特征；與α-地貧基因突變譜不同，β-地貧基因的常見突變基因點較多，疊加外省移民流入省內(nèi)各地區(qū)的人群差異，使外省移民引發(fā)對當?shù)卅?地貧基因譜的稀釋及混雜效應各異，長期影響下形成了省內(nèi)各地貧高發(fā)地區(qū)β-地貧基因突變譜各自的特征，并可能隨移民規(guī)模與持續(xù)時間的影響而持續(xù)存在［24］。

上述區(qū)域α-地貧基因譜相對“穩(wěn)定”的特征提示：相當長的時間內(nèi)，以α-地貧基因東南亞型（αα/--SEA）為病理基礎的巴氏（Bart's）水腫胎及中重型血紅蛋白H ?。℉b H ?。┨旱脑缙谧R別與防控仍是廣東省α-地貧同型夫婦遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷工作的主要內(nèi)容。β-地貧基因分布上的“多樣性”特征亦提示：未來β-地貧同型夫婦的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷工作將面對更為復雜的β-地貧基因突變及其組合。

綜上所述，惠州市育齡人群中α-和β-地貧總體攜帶率仍較高，α-地貧突變譜與本省其他高發(fā)地區(qū)相似，β-地貧突變譜則呈現(xiàn)本地化特征，且同時存在一定比例的α+β-復合型地貧，臨床進行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷時尤應警惕［25］。作為首次在惠州市育齡人群中開展的大規(guī)模地貧分子流行病學調(diào)查研究，對強化該地區(qū)地貧防控具有重要意義。