李翔　杜雙林　朱文平　張毅

摘要：在粳稻品種中花11的組培后代中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)無花粉型雄性不育突變體osnp3。該突變體花藥細(xì)長(zhǎng)且呈白色半透明狀，花藥中無成熟花粉粒，但其株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀與野生型中花11無明顯差異?；ㄋ幇氡∏衅^察表明，突變體osnp3在花藥發(fā)育過程中其絨氈層細(xì)胞延遲降解，小孢子細(xì)胞淀粉未充實(shí)，最終小孢子細(xì)胞退化降解，花藥亦不能開裂。用突變體osnp3雜合株后代分離群體研究其遺傳規(guī)律，表明突變體osnp3受1對(duì)隱性核基因控制。利用秈稻明恢63（MH63）與突變體osnp3雜交的F₂定位群體將突變基因定位于第4染色體長(zhǎng)臂C04D1、C04D3這2個(gè)標(biāo)記之間，并與標(biāo)記04008、C04D2共分離，物理距離約為0.96 Mb。測(cè)序表明，在定位區(qū)間內(nèi)，1個(gè)編號(hào)為L(zhǎng)OC_Os04g51070的基因第3外顯子中插入了約4 kb的逆轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致其功能缺失突變。該基因編碼1個(gè)含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，推測(cè)其通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與花藥絨氈層細(xì)胞的降解；而其突變后絨氈層細(xì)胞未能正常降解，從而引起花粉敗育。

關(guān)鍵詞：水稻；隱性雄性不育；基因定位；osnp3

中圖分類號(hào)：S511.035.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2023）11-0106-07

水稻雄性不育是指水稻花藥無法產(chǎn)生正常功能的花粉，而其雌性生殖器官功能正常，異花授粉可以正常結(jié)實(shí)的現(xiàn)象。水稻花藥的發(fā)育歷程極其復(fù)雜，小孢子在此階段經(jīng)歷減數(shù)分裂、有絲分裂，雄蕊原基不斷分裂分化，形成表皮層、內(nèi)皮層、中間層、絨氈層，隨后又不斷降解。有學(xué)者對(duì)擬南芥花藥發(fā)育進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)合水稻花藥發(fā)育過程形態(tài)變化，對(duì)水稻花藥發(fā)育的時(shí)期作了新的14期劃分［1-3］。水稻花藥在發(fā)育的14個(gè)時(shí)期中，均受到一系列相關(guān)基因的精準(zhǔn)調(diào)控，任何關(guān)于小孢子發(fā)育的調(diào)控基因、減數(shù)分裂基因、絨氈層發(fā)育調(diào)控因子、花粉囊和花粉外壁調(diào)控因子、花藥開裂調(diào)控因子等基因發(fā)生突變，均會(huì)引起花藥發(fā)育異常，最終導(dǎo)致水稻雄性不育［4］。

目前已鑒定出大量與水稻雄性不育有關(guān)的基因［5］，包括與絨氈層細(xì)胞發(fā)育和降解相關(guān)的基因Undeveloped Tapetum1（UDT1），該基因調(diào)節(jié)與控制花藥最內(nèi)層絨氈層細(xì)胞的基因表達(dá)以及花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂［6］。UTD1突變體的絨氈層在減數(shù)分裂期時(shí)空泡化，中間層的降解并未正常進(jìn)行，出現(xiàn)延遲，由此引起性母細(xì)胞不能發(fā)育成花粉，導(dǎo)致花粉的完全敗育。Tapetum Degeneration Retardation（TDR）在絨氈層細(xì)胞PCD過程和形成花粉壁過程起到正向調(diào)控的作用，其內(nèi)在機(jī)制是直接結(jié)合到PCD基因OsCP1和OsC6啟動(dòng)子區(qū)，在TDR突變體中，絨氈層細(xì)胞核中間層細(xì)胞的降解均出現(xiàn)延遲現(xiàn)象，小孢子從四分體中釋放后被迅速降解，因此導(dǎo)致雄性不育［7］；Eternal Tapetum1（EAT1）［8］是作用在TDR的下游，兩者共同調(diào)節(jié)絨氈層的降解與花粉發(fā)育。EAT1還可以通過直接調(diào)控位于其下游的天冬氨酸蛋白酶基因OsAP25、OsAP37的表達(dá)，正向調(diào)控絨氈層PCD。Tdr Interacting Protein2（TIP2）通過作用在UDT1、GAMYB的下游和TDR、EAT1的上游，直接調(diào)控兩者的表達(dá)［9-10］。GAMYB4基因通過編碼赤霉素誘導(dǎo)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控水稻絨氈層PCD以及花粉發(fā)育的過程，同時(shí)也影響花粉囊和糊粉層發(fā)育過程中淀粉酶的表達(dá)［11］。API5（Apoptosis Inhibitor 5）基因通過編碼1個(gè)動(dòng)物抗凋亡蛋白的同源蛋白，正向調(diào)控絨氈層PCD，API5突變體抑制PCD過程，延遲絨氈層細(xì)胞的降解，引起小孢子發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致花粉敗育［12］。Persistent Tapetal Cell1（PTC1）基因通過編碼PHD-finger轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控絨氈層細(xì)胞發(fā)育與花粉粒的形成［13］，在花粉發(fā)育的第8至第9時(shí)期［1］，PTC1基因主要是在絨氈層細(xì)胞和小孢子細(xì)胞中表達(dá)，在ptc1突變體中，絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)了降解延遲，并且呈炭疽狀壞死現(xiàn)象，花粉壁細(xì)胞與花粉發(fā)育也出現(xiàn)了異常，由此導(dǎo)致典型的花粉敗育。OsNP1是通過編碼一種葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，在絨氈層和小孢子中特異表達(dá)，調(diào)節(jié)絨氈層PCD及花粉外壁形成［14］。BayMax1（BM1）［15］、Earlier Degraded Tapetum1（EDT1）［16］、OsALDH2b［17］、Tdr Interacting Protein3（TIP3）［18］、GAMYB5［19］、Microspore and Tapetum Regulator1（MTR1）［20］等一系列相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因分別通過直接激活目標(biāo)基因，或通過彼此之間的間接調(diào)節(jié)，并同時(shí)協(xié)同調(diào)控共同靶基因的表達(dá)等不同方式，直接或者間接調(diào)控水稻絨氈層PCD，其隱性突變則會(huì)導(dǎo)致絨氈層降解提前或者延遲，最終導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻，出現(xiàn)雄性不育。

水稻的雄性不育在雜種優(yōu)勢(shì)利用中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，我國最早的三系雜交水稻育種技術(shù)用核質(zhì)互作雄性不育創(chuàng)造了不育系和保持系，實(shí)現(xiàn)了三系配套［21］；隨后進(jìn)一步利用光溫敏雄性核不育，實(shí)現(xiàn)了不育系和保持系的一系兩用，創(chuàng)造了兩系雜交水稻育種技術(shù)［22］，為我國雜交水稻育種作出了貢獻(xiàn)。隨著分子設(shè)計(jì)育種的進(jìn)一步深入，鄧興旺等也進(jìn)一步提出水稻智能不育分子設(shè)計(jì)育種——第3代雜交育種技術(shù)（G3育種技術(shù)）［23-24］，解決了雜交稻育種過程中資源利用率低、育種周期長(zhǎng)等瓶頸問題。這樣的新型不育系兼具三系法的穩(wěn)定性和兩系法不受恢保關(guān)系影響、配組靈活的優(yōu)點(diǎn)，比三系和二系雜交水稻育種技術(shù)又進(jìn)了一步，使得更多的水稻普通隱性雄性不育材料的有了應(yīng)用前景。

本研究在粳稻品種中花11組培后代中鑒定出1個(gè)無花粉型雄性不育突變體，命名為osnp3，遺傳分析表明該性狀受1對(duì)隱性核不育基因控制。以該突變體為研究對(duì)象，進(jìn)行了花藥發(fā)育過程的初步觀察，并對(duì)osnp3基因進(jìn)行了定位和候選基因分析，旨在深入了解水稻雄配子發(fā)育的分子機(jī)理，以及為隱性雄性核不育及相關(guān)基因在雜交水稻育種中的應(yīng)用提供種質(zhì)資源和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

osnp3是從粳稻品種中花11組培后代中鑒定出的一個(gè)無成熟花粉粒的雄性不育突變體。用秈稻明恢63（MH63）與突變體osnp3雜交后產(chǎn)生的F₂代作為定位群體。所有材料于2019—2021年種植在云南省西雙版納傣族自治州景洪市嘎灑鎮(zhèn)試驗(yàn)基地，種植和管理同大田生產(chǎn)。

1.2遺傳規(guī)律分析及基因定位群體的構(gòu)建

以突變體osnp3雜合株后代作為分離群體，統(tǒng)計(jì)表型正常和不育株的分離比例，用于遺傳分析。以秈稻明恢63（MH63）作為父本、突變體osnp3作為母本雜交，其F₂代作為定位群體。

1.3花粉碘染觀察

開花期，在田間分別隨機(jī)選取野生型中花11和突變體osnp3植株各3株，每株隨機(jī)采集主穗中上部3朵穎花，用1.5% I2-KI溶液染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉育性。

1.4突變體osnp3花藥的半薄切片觀察

取野生型中花11和突變體osnp3不同發(fā)育時(shí)期的穎花，于戊二醛固定液中（3.5%，用0.2 mol/L的PBS配制，PBS最終濃度為0.1 mol/L） 固定；利用真空泵抽氣，緩慢放氣，重復(fù)至樣品全部沉底，然后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；?.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，沖洗完成后盡量吸干磷酸緩沖液后再用1%的鋨酸固定1～2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液置換2次，每次10 min左右；梯度乙醇脫水和無水丙酮脫水；再用包埋劑和丙酮混合液預(yù)包埋浸透2 h，換純包埋劑滲透2 h，60 ℃恒溫箱中烘烤4 d左右。用Leica RM2265半薄切片機(jī)橫切花藥，切片厚度為 3 μm。甲苯胺藍(lán)染色后用Leica DM200光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.5DNA的提取和基因定位

在F₂定位群體中，隨機(jī)選取15株野生型單株和15株突變體單株，各剪取適量葉片混合，液氮研磨后，CTAB抽提，構(gòu)建可育基因池和不育基因池；F₂群體則單株提取。利用實(shí)驗(yàn)室預(yù)先設(shè)計(jì)好的137對(duì)InDel引物在基因池間篩選多態(tài)性標(biāo)記。對(duì)在基因池間呈多態(tài)性的標(biāo)記進(jìn)行連鎖驗(yàn)證，用連鎖標(biāo)記對(duì)F₂群體的不育單株進(jìn)行基因型分析。根據(jù)不同連鎖標(biāo)記的交換子數(shù)量及分布，結(jié)合標(biāo)記的物理位置確定初步定位區(qū)間。

在初步定位的區(qū)間內(nèi)用Premier 5.0軟件進(jìn)一步設(shè)計(jì)開發(fā)InDel標(biāo)記，對(duì)突變基因進(jìn)行精細(xì)定位。所用引物（表1）均由Tiangen生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用12.5 μL反應(yīng)體系：ddH2O? 8.875 μL；Buffer 1.25 μL；dNTPs 0.25 μL；Primer 1 μL；Polymerase 0.125 μL；模板DNA 1 μL。PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1% AgNO3染色，甲醛和NaOH顯色。

1.6候選基因分析

用突變體osnp3雜合株后代分離群體作為測(cè)序群體，在開花期取可育、不育個(gè)體各30株的葉片分別提取DNA，混合成可育基因池、不育基因池，送到天津諾禾致遠(yuǎn)公司進(jìn)行基因組重測(cè)序。利用IGV分析定位區(qū)間內(nèi)發(fā)生突變的位點(diǎn)，在水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)庫（http//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中進(jìn)行比對(duì)和查閱，以確定目的基因及相關(guān)信息。

2結(jié)果與分析

2.1突變體osnp3表型分析

突變體osnp3在株高、有效穗、穗粒數(shù)等株型性狀（圖1）和穗部性狀較野生型中花11（圖2-A、圖2-B）無明顯差異。野生型中花11的花藥飽滿呈黃色，而突變體osnp3的花藥瘦小呈白色（圖2-C至圖2-F）。花粉鏡檢結(jié)果顯示，野生型中花11的花粉粒全部被I2-KI染成黑色，而突變體osnp3花藥無花粉粒釋放出來，完全敗育 （圖2-G、圖2-H）。該結(jié)果表明，相關(guān)基因?qū)χ匾霓r(nóng)藝性狀、花器官形態(tài)無明顯影響，但對(duì)花藥形態(tài)和花粉發(fā)育有嚴(yán)重影響。

通過花藥半橫切來觀察野生型和突變體osnp3在花藥發(fā)育過程中的差異。將花藥發(fā)育劃分為14個(gè)階段［1］，在第10期之前，野生型和突變體osnp3的花藥發(fā)育過程無明顯差異。在野生型中，第10期（圖3-A）絨氈層繼續(xù)退化，呈山丘狀，小孢子液泡變大，呈圓球形；第11期（圖3-B），絨氈層降解成為薄薄一層，附著在內(nèi)壁上，小孢子呈鐮刀型；在第12期（圖3-C），此時(shí)已經(jīng)見不到絨氈層細(xì)胞的痕跡，小孢子也因?yàn)閮?nèi)部飽含淀粉和脂質(zhì)等物質(zhì)而變圓；在第13、14期，花粉因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷積累而

更充實(shí)，花藥壁變得更薄，最后花藥開裂，完成散粉。而在突變體osnp3中，在第10期（圖3-F）的時(shí)候能夠觀察到正常的絨氈層，且與野生型并無明顯差異，小孢子發(fā)育也正常；但是在第11期（圖3-G），絨氈層并未降解，小孢子發(fā)育未見異常；在第12期（圖3-H），絨氈層細(xì)胞依然存在，小孢子開始皺縮，在正常情況下，此時(shí)的小孢子內(nèi)部應(yīng)該充斥淀粉脂質(zhì)等物質(zhì)，正是因?yàn)榻q氈層未能降解，不能為小孢子的成熟提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及騰出空間，導(dǎo)致在第12期時(shí)小孢子的皺縮及隨后的降解，也導(dǎo)致第13期（圖3-I）和第14期（圖3-J）沒有成熟的花粉粒。上述觀察結(jié)果表明，突變體osnp3的花藥絨氈層細(xì)胞降解異常，小孢子細(xì)胞在有絲分裂階段無法積累淀粉，不能完成花粉充實(shí)，小孢子細(xì)胞退化，最終不能發(fā)育出成熟的花粉粒，導(dǎo)致敗育。

2.2突變體osnp3不育性的遺傳規(guī)律分析

osnp3和野生型的雜交F₁育性正常，F(xiàn)₂育性分離，正常株與不育株的比例經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合3 ∶1（表2），表明正常表型對(duì)突變表型為顯性，該突變體的雄性不育受一個(gè)隱性核基因控制。

2.3目的基因的定位

選取平均分布于12條染色體上的137對(duì)InDel標(biāo)記，在osnp3×MH63的F₂群體可育基因池和不育基因池之間篩選多態(tài)性標(biāo)記，最終在第4染色體（圖4-A）上篩選到9對(duì)在基因池間呈現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記04007、04010、0413、0420、0421、0424、0425、0426、0429 （表1）。將4對(duì)（0420、0424、0426、04010）在基因池間表現(xiàn)差異的標(biāo)記用F₂定位群體中的15株可育株與15株不育株進(jìn)行單株驗(yàn)證，均呈現(xiàn)連鎖。用這4個(gè)標(biāo)記對(duì)F₂中35株不育株進(jìn)行群體篩選，標(biāo)記0420單交換株數(shù)為7，雙交換株數(shù)為2，重組配子數(shù)為11；標(biāo)記0424單交換株數(shù)為4，雙交換株數(shù)為0，重組配子為4；標(biāo)記0426單交換株數(shù)為0，雙交換株數(shù)為0，重組配子數(shù)為0；標(biāo)記04010單交換株數(shù)為3，雙交換株數(shù)為0，重組配子數(shù)為3。其中標(biāo)記0424的交換株與標(biāo)記0420完全重合，標(biāo)記0420與0424交換株與標(biāo)記04010完全不重合，最終得出該突變位置位于標(biāo)記0424與04010之間，與標(biāo)記0426共分離（圖4-B）。

在初步定位的區(qū)間內(nèi)用Premier 5.0軟件及在Gramene（http：//www.gramene.org）Blast分析，進(jìn)一步設(shè)計(jì)開發(fā)多態(tài)性標(biāo)記，其中C04D1、C04D2、C04D3、C04D5、04008在親本（秈稻明恢MH63和突變體osnp3）間呈現(xiàn)多態(tài)性。用這5對(duì)引物對(duì)F₂定位群體中65株不育株進(jìn)行群體篩選，其中標(biāo)記C04D1單交換株數(shù)為17，雙交換株數(shù)為1，重組配子數(shù)為19；標(biāo)記04008單交換株數(shù)為0，雙交換株數(shù)為0，重組配子數(shù)為0；標(biāo)記C04D2單交換株數(shù)為0，雙交換株數(shù)為0，重組配子數(shù)為0；標(biāo)記C04D3單交換株數(shù)為2，雙交換株數(shù)為0，重組配子數(shù)為2；標(biāo)記C04D5單交換株數(shù)為21，雙交換株數(shù)為0，重組配子數(shù)為21，且標(biāo)記C04D3交換株與標(biāo)記C04D5完全重合，與標(biāo)記C04D1完全不重合。因此將目標(biāo)基因定位于標(biāo)記C04D1和標(biāo)記C04D3之間，與標(biāo)記04008和標(biāo)記C04D2共分離 （圖4-C）。

2.4重測(cè)序確定候選基因

根據(jù)重測(cè)序的結(jié)果（圖5-A），在定位區(qū)間內(nèi)，發(fā)現(xiàn)突變體osnp3中，注釋基因LOC_Os04g51070第3外顯子上有大約4 kb的逆轉(zhuǎn)座子插入（圖5-B）。根據(jù)以上結(jié)果，將LOC_Os04g51070確定為osnp3的候選基因。

根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（Rice Genome Annotation Project）提供的水稻基因組注釋序列，該候選基因LOC_Os04g51070編碼1個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與水稻花藥絨氈層細(xì)胞的降解。此前有報(bào)道闡述了EAT1基因編碼1個(gè)控制絨氈層表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，該報(bào)道中的EAT1基因［8］與本研究中的突變基因?yàn)橥换?。由于逆轉(zhuǎn)座子的插入導(dǎo)致該基因的功能缺失，從而使絨氈層細(xì)胞PCD失敗，引起花粉敗育。

3討論

本研究中，突變體osnp3表現(xiàn)出花藥瘦小呈白色透明，經(jīng)I2-KI染色壓片后，藥室中并未觀察到花粉粒，完全敗育?；ㄋ幇氡∏衅@示突變體osnp3絨氈層細(xì)胞降解異常，最終導(dǎo)致小孢子發(fā)育失敗，形成無花粉型雄性不育。遺傳分析和基因定位表明，突變體osnp3由1對(duì)隱性核基因控制，位于第4染色體長(zhǎng)臂的C04D1、C04D3這2個(gè)標(biāo)記間， 與04008、

C04D2標(biāo)記共分離，物理距離約為0.96 Mb。經(jīng)過基因組重測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域中編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因LOC_Os04g51070的第3外顯子有大約 4 kb 的逆轉(zhuǎn)座子插入，最終導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞PCD失敗，由此導(dǎo)致突變體osnp3敗育。

本研究中的突變體osnp3是雄性不育基因EAT1＼DTD的一個(gè)等位突變體EAT1［8］，EAT1表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞的延遲死亡，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP末端標(biāo)記（TUNEL）檢測(cè)和透射電鏡（TEM）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在eat1絨氈層細(xì)胞中，直到花藥發(fā)育第10期，均未觀察到明顯的DNA碎片信號(hào)。在第11期，突變體eat1花藥的所有4層均可見微弱的DNA片段信號(hào)，提示PCD延遲和異常。本研究的突變體osnp3花藥半薄切片發(fā)現(xiàn)的敗育特征與eat1的敗育特征一致。

Ono等的研究表明，EAT1是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子，是減數(shù)分裂后花藥絨氈層程序性細(xì)胞死亡（PCD）的關(guān)鍵，其他bHLH蛋白TIP2和UDT1也在這一過程中發(fā)揮了重要作用［25］。

水稻隱性核不育對(duì)改進(jìn)水稻種群有積極的作用，利用雜交、回交、測(cè)交等育種方法，使優(yōu)勢(shì)基因聚集，從而使表型更優(yōu)良，創(chuàng)造出更具競(jìng)爭(zhēng)力的雜交水稻品種。本研究以中花11組培后代中的突變體osnp3為對(duì)象，觀察了其表型及研究了遺傳規(guī)律，并且利用不育突變體osnp3與MH63雜交衍生的分離群體，成功地將osnp3定位于水稻第4染色體上C04D1、C04D3這2個(gè)標(biāo)記間，與04008、C04D2標(biāo)記共分離，通過重測(cè)序確定了候選基因。下一步需要設(shè)計(jì)相關(guān)引物，通過PCR擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)可能的插入突變，還需構(gòu)建互補(bǔ)表達(dá)載體驗(yàn)證OsNP3基因的功能等，以進(jìn)一步了解改基因的功能，旨在為其在雜交稻選育中的利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Zhang D B，Luo X，Zhu L. Cytological analysis and genetic control of rice anther development［J］. Journal of Genetics and Genomics，2011，38（9）：379-390.

［2］Ma H. Molecular genetic analyses of microsporogenesis and microgametogenesis in flowering plants［J］. Annual Review of Plant Biology，2005，56：393-434.

［3］Sanders P M，Bui A Q，Weterings K，et al. Anther developmental defects in Arabidopsis thaliana male-sterile mutants［J］. Sexual Plant Reproduction，1999，11（6）：297-322.

［4］彭澤群，龔柯，陳代波，等. 水稻雄性不育突變體tip2-zh的鑒定與基因定位［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2021，22（4）：1068-1080.

［5］馬西青，方才臣，鄧聯(lián)武，等. 水稻隱性核雄性不育基因研究進(jìn)展及育種應(yīng)用探討［J］. 中國水稻科學(xué)，2012，26（5）：511-520.

［6］Jung K H，Han M J，Lee Y S，et al. Rice Undeveloped Tapetum1 is a major regulator of early tapetum development［J］. The Plant Cell，2005，17（10）：2705-2722.

［7］Li N，Zhang D S，Liu H S，et al. The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetum degradation and anther development［J］. The Plant Cell，2006，18（11）：2999-3014.

［8］Niu N N，Liang W，Yang X J，et al. EAT1 promotes tapetal cell death by regulating aspartic proteases during male reproductive development in rice［J］. Nature Communications，2013，4（1）：1455.

［9］Ko S S，Li M J，Sum-Ben K M，et al. The bHLH142 transcription factor coordinates with TDR1 to modulate the expression of EAT1 and regulate pollen development in rice［J］. Plant Cell，2014，26（6）：2486-2504.

［10］Fu Z Z，Yu J，Cheng X W，et al. The rice basic helix-loop-helix transcription factor TDR INTERACTING PROTEIN2 is a central switch in early anther development［J］. Plant Cell，2014，26（4）：1512-1524.

［11］Liu Z H，Bao W J，Liang W Q，et al. Identification of gamyb-4 and analysis of the regulatory role of GAMYB in rice anther development［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2010，52（7）：670-678.

［12］Li X W，Gao X Q，Wei Y，et al. Rice APOPTOSIS INHIBITOR5 coupled with two DEAD-box adenosine 5′-triphosphate-dependent RNA helicases regulates tapetum degeneration［J］. The Plant Cell，2011，23（4）：1416-1434.

［13］Li H，Yuan Z，Vizcay-Barrena G，et al. PERSISTENT TAPETAL CELL1 encodes a PHD-finger protein that is required for tapetal cell death and pollen development in rice［J］. Plant Physiology，2011，156（2）：615-630.

［14］Chang Z Y，Chen Z F，Wang N，et al. Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear male sterility gene［J］. 2017，114（1）：14145-14150.

［15］Xiang X J，Sun L P，Yu P，et al. The MYB transcription factor Baymax1 plays a critical role in rice male fertility［J］. Theoretical and Applied Genetics，2021，134（2）：453-471.

［16］Bai W T，Wang P R，Hong J，et al. Earlier degraded Tapetum1 （EDT1） encodes an ATP-citrate lyase required for tapetum programmed cell death［J］. Plant Physiology，2019，181（3）：1223-1238.

［17］Xie X R，Zhang Z X，Zhao Z，et al. The mitochondrial aldehyde dehydrogenase OsALDH2b negatively regulates tapetum degeneration in rice［J］. Journal of Experimental Botany，2020，71（9）：2551-2560.

［18］Yang Z F，Sun L P，Zhang P P，et al. TDR INTERACTING PROTEIN 3，encoding a PHD-finger transcription factor，regulates Ubisch bodies and pollen wall formation in rice［J］. Plant Journal，2019，99（5）：844-861.

［19］楊正福，張迎信，孫廉平，等. 水稻雄性不育突變體gamyb5的鑒定與基因定位［J］. 中國水稻科學(xué)，2016，30（2）：143-151.

［20］Tan H X，Liang W Q，Hu J P，et al. MTR1 encodes a secretory fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in rice［J］. Developmental Cell，2012，22（6）：1127-1137.

［21］梁滿中，王鋒，殷小林，等. 水稻的雄性不育性及其在雜種優(yōu)勢(shì)中的利用［J］. 生命科學(xué)研究，2021，25（5）：377-385，392.

［22］袁隆平. 兩系法雜交水稻研究的進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990，23（3）：1-6.

［23］鄧興旺，王海洋，唐曉艷，等. 雜交水稻育種將迎來新時(shí)代［J］. 中國科學(xué)：生命科學(xué)，2013，43（10）：864-868.

［24］袁隆平. 第三代雜交水稻初步研究成功［J］. 科學(xué)通報(bào)，2016，61（31）：3404.

［25］Ono S，Liu H，Tsuda K，et al. EAT1 transcription factor，a non-cell-autonomous regulator of pollen production，activates meiotic small RNA biogenesis in rice anther tapetum［J］. PLoS Genetics，2018，14（2）：e 1007238.