徐達勛　顏振峰

摘要：采用大棚劃區(qū)試驗，設置不施氮肥處理（CK），不施氮條件下施用生物炭和根際促生菌處理（PB），常規(guī)施氮處理（NN），常規(guī)施氮條件下分別施入根際促生菌處理（NP）、生物炭處理（NB）、根際促生菌+生物炭配施處理（NPB），探索了生物炭與根際促生菌對辣椒氮素利用率、產(chǎn)量及土壤氮轉化的影響。結果表明，與CK處理相比，施氮、生物炭、根際促生菌相關處理（NN、NP、NB、NPB）整體提高了辣椒植株的氮素累積量、產(chǎn)量及土壤氮轉化，不施氮相關處理（PB、CK）效果相當。在施氮處理中，與NN處理相比，NB、NPB處理均增加了辣椒植株各個器官的氮素累積量，調節(jié)了土壤氮代謝酶、提高了生育前期的土壤NO^-₃-N、NH⁺₄-N含量及土壤硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的豐度，整體以NPB處理較高；NPB處理的產(chǎn)量、氮素利用率（NUE）最高，比NN處理分別顯著提高9.13%、6.57%。相關分析結果表明，植株氮含量、產(chǎn)量、NUE與土壤氮組分、氮代謝酶存在顯著或極顯著相關關系。生物炭和根際促生菌的聯(lián)合施用，可增加辣椒根際土壤中氮功能菌的增殖和調控N轉化酶的活性，增加土壤氮的有效性，從而提高辣椒植株的氮含量、產(chǎn)量及氮素利用率。

關鍵詞：生物炭；辣椒；根際促生菌；氮轉化；氮素利用率（NUE）；產(chǎn)量

中圖分類號：S641.306文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0133-07

根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）指自由生活或附生于植物根系土壤微域的一類有益菌類，它可促進植物生長、提高宿主對礦質營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物［1］。PGPR具有生物固氮、溶磷、解鉀、分泌抗生素及促進激素合成等功能［2］。研究表明，PGPR可以在正常和脅迫環(huán)境中促進植物生長，提高土壤肥力和改善土壤質地，因此在農林業(yè)中普遍用作生防菌劑、肥料及土壤改良劑，并有望在未來替代化肥和農藥［3］。然而，在某些環(huán)境中，目標菌株可能無法發(fā)揮有效作用，因為菌株在特定環(huán)境中可能會因與土著菌株競爭或因條件苛刻而無法生存［4］。載體材料可以通過提供空間保護、改善土壤結構及免受土壤動物取食的特點，使其更有利于微生物的定殖，從而提高微生物接種的成功率［5］。

生物炭（biochar）是植物殘體、城市垃圾及畜禽糞便等生物質材料在高溫、缺氧條件下熱裂解而得到的一類富碳有機物質［6］。生物炭具有良好的孔隙結構、較高的pH值、較大的比表面積及優(yōu)良的養(yǎng)分底物激發(fā)性能［7］。大量研究表明，生物炭可有效降低土壤容重，提高養(yǎng)分有效性，增加土壤保墑性能及吸附金屬污染物等，從而改善土壤理化性質，提高土壤肥力［8］。此外，生物炭在調節(jié)土壤生物學特性方面也發(fā)揮著重要作用。研究表明，外源施用生物炭，可誘導土壤微生物群落發(fā)生顯著變化，影響土壤微生物的組成和相關種類的豐度［9］。這表明，生物炭有利于土壤微生物的增殖，這些變化可能會驅動養(yǎng)分循環(huán)，直接或間接影響植物生長［10］。然而，目前關于生物炭與微生物組配施用的效果知之甚少。

辣椒是全球廣泛種植的重要蔬菜之一，是保證民生的重要食材。氮素是辣椒生長發(fā)育過程中所需最多的礦質元素之一，氮素對保證辣椒產(chǎn)量、品質及成品風味具有至關重要的作用［11］。然而在辣椒的田間生產(chǎn)中，施氮量與產(chǎn)量間存在閾值。近年來，氮肥的過量施用已成為蔬菜可持續(xù)化生產(chǎn)的瓶頸問題，其在造成環(huán)境污染的同時伴隨著生產(chǎn)成本的增加［12］。目前關于提升辣椒氮素利用率的研究主要集中在優(yōu)化肥料施用措施、新型肥料研發(fā)及新品種培育上，較少關注生物技術對氮素利用及養(yǎng)分周轉的影響。基于此，本研究探索了生物炭、根際促生菌對辣椒氮素利用效率、產(chǎn)量及土壤氮轉化的影響，以期為農林業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試地點與供試材料

試驗于2022年4—8月在鹽城生物工程高等職業(yè)技術學校蔬菜試驗大棚中進行。供試辣椒品種為蘇椒5號，購自江蘇省江蔬種苗科技有限公司。種子于45 ℃水浴中進行表面滅菌15 min，蒸餾水浸泡2 h，采用蔬菜育苗盤培養(yǎng)至4葉期。

供試生物炭購自勤豐眾成生物質新材料（南京）有限公司，采用水稻秸稈在低氧、450 ℃條件下連續(xù)炭化 45 min 制得，其基本性質為：全碳含量66.72%，總氮含量5.99%，比表面積19.05 m²/g，pH值8.65。PGPR菌株為解膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、多黏芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），已證實該復合菌株可有效提高蔬菜植物的生長［4］，施用菌落濃度約為2×10⁸CFU/mL。供試氮磷鉀肥分別為尿素（46%N）、過磷酸鈣（46%P₂O₅）、氯化鉀（60%K₂O），均為分析純，皆購自默克化學試劑（北京）有限公司。大棚0～30 cm表層土壤理化性質：pH值為6.96，有機質、全氮含量分別為31.25、1.69 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為130.33、26.01、158.64 mg/kg。

1.2試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，設置氮素（N）、生物炭（B）、根際促生菌（P）共6個組合處理，分別為：CK處理，不施氮+不接種根際促生菌+不施生物炭處理；PB處理，不施氮+生物炭+接種根際促生菌處理；NN處理，常規(guī)施氮+不施生物炭+不接種根際促生菌處理；NP處理，常規(guī)施氮+不施生物炭+接種根際促生菌處理；NB處理，常規(guī)施氮+生物炭+不接種根際促生菌處理；NPB處理，常規(guī)施氮+生物炭+接種根際促生菌處理。每個處理重復3次，共18個小區(qū)。每個小區(qū)面積為20 m²（5 m×4 m），小區(qū)間采用50 cm寬的淺溝攔隔。

施氮處理中，辣椒移栽前條施尿素、過磷酸鈣和氯化鉀（N 180 kg/hm²，N ∶P₂O₅∶K₂O=5 ∶4 ∶4），無氮處理則施入相應的磷鉀肥；生物炭處理施用量為3 000 kg/hm²，根際促生菌處理施用量為100 mL/穴。采用旋轉耕茬機以30 cm深度耕作并起壟。辣椒苗移栽為2株/穴，種植密度為52 500株/hm²。NPB處理中，促生菌與生物炭提前拌勻施入。試驗過程中辣椒灌溉、除草及病蟲害防治按照常規(guī)方法進行，試驗培育104 d。

1.3樣品采集及測定分析

1.3.1土壤、植物樣品采集培養(yǎng)結束后，去除 0～1 cm表層土壤。用鐵鏟將辣椒根系完整挖出，去除距離根系較遠的外圍土壤，小心抖動根系表面土壤，無法抖落的土壤采用干凈刷子輕輕刷落，保存辣椒植株于-20 ℃環(huán)境，且將各處理的土壤混合后分為2個部分：一部分保存于-80 ℃，用于土壤微生物豐度分析；一部分保存于-20 ℃，用于土壤酶活性和土壤氮組分分析。

1.3.2辣椒氮素含量、產(chǎn)量因子測定將辣椒果實、根系、莖稈及葉片分離，分別置于105 ℃烘箱中殺青0.5 h，隨后于65 ℃烘干至恒質量，采用研磨機研磨過 0.25 mm網(wǎng)篩以測定全氮含量；全氮含量使用H₂SO₄-H₂O₂法消化后，采用半微量開氏法測定。氮素利用率（NUE）=（施氮處理辣椒氮總吸收量-不施氮處理辣椒氮總吸收量）/施氮量×100%［13］。辣椒成熟后人工采摘計算掛果數(shù)和稱量單椒質量，水分比例為辣椒鮮重與干重間的差值再與鮮重之比，每公頃干椒產(chǎn)量由取樣面積產(chǎn)量換算得來。

1.3.3土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及土壤氮相關酶活性測定土壤銨態(tài)氮（NH⁺₄-N）、硝態(tài)氮（NO^-₃-N）均采用KCl浸提，隨后分別采用苯酚鈉-乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸-乙二胺四乙酸二鈉高速溶解，接著采用連續(xù)流動分析儀（SmartChem201，AMS/Alliance，Italy）測定。

土壤酶活指標包括硝酸還原酶（NR）、脲酶（UE）、過氧化氫酶（CAT）、中性蛋白酶（NTP）活性，分別采用T007-1-1、A121-1-1、T005-1-1、T016-1-1試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。

1.3.4氮功能菌絕對豐度測定微生物豐度采用微生物群落GeoChip 4.0高通量平臺-微陣列系統(tǒng)進行測定分析。稱取250 mg樣品，采用Soil Genome Extraction Kit試劑盒（SoMio N055，寶生物工程（大連）有限公司 ）進行DNA提取。細菌擴增引物采用16S rRNA V3～V4區(qū)間：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG），806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。DNA純度、數(shù)量分別使用紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE）、立體讀取系統(tǒng)（Stereo star Optimai BMG Labtech，Jena，Germany）檢測。將檢測合格的DNA樣品進行熒光標記、芯片雜交、掃描，具體步驟參考劉鑫軍等的方法［14］。GeoChip 4.0高通量平臺-微陣列系統(tǒng)數(shù)據(jù)的標準化處理采用片間法進行歸一化。舍棄信噪比低于2.0的低質量片段，將測定值標準化為數(shù)字信息［15］。上述氮功能菌豐度分析委托南京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，采用DPS 14.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和相關性分析，采用鄧肯式多重比較進行統(tǒng)計分析（α=0.05），采用R語言、Origin 9.1進行圖形繪制。

2結果與分析

2.1生物炭與根際促生菌配施對植株氮素分布及利用率的影響

由圖1-A可知，辣椒植株各器官氮含量表現(xiàn)為葉部＜根系＜辣椒果實＜莖稈，其中根系、莖稈、葉部、辣椒果實中氮素含量分別占總氮素含量的21.09%～24.19%、35.92%～45.13%、6.53%～8.75%、26.53%～32.19%。從試驗數(shù)據(jù)來看，在根系、莖稈、葉部、辣椒果實的氮含量均以NPB處理最高，各處理氮含量呈CK、PB ＜NP、NN＜NB＜NPB，且在任一器官中，NPB處理均顯著大于CK、PB、NN處理。而就總氮素含量而言，各處理呈 PB＜CK＜NP

2.2生物炭與根際促生菌配施對辣椒產(chǎn)量及其構成因子的影響

由表1可知，掛果數(shù)中，各處理表現(xiàn)為CK＜PB＜NP

2.3生物炭與根際促生菌配施對土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響

由圖2可知，無論土壤硝態(tài)氮（NO^-₃-N）還是銨態(tài)氮（NH⁺₄-N）含量中，隨著生育期推進，各處理整體均呈降低趨勢，其中NO^-₃-N、NH⁺₄-N含量分別在幼苗期至揚花期、揚花期至坐果期階段降幅最為明顯；且無論NO^-₃-N還是NH⁺₄-N含量中，任一生育期中未施氮處理（CK、PB）的含量均較低。與NB處理相比，生物炭與根際促生菌配施（NPB）處理均提高了辣椒揚花期和成熟期土壤NO^-₃-N含量以及辣椒揚花期土壤NH⁺4-N含量。與NN處理相比，NP處理對土壤NH⁺₄-N、NO^-₃-N含量無顯著影響。辣椒成熟期NB、NPB處理的土壤 NO^-₃-N 含量分別比NN處理顯著提高42.79%、87.25%；在辣椒整個生育期，NPB處理的土壤 NO^-₃-N 含量平均比NB處理高17.33%，這意味著NPB處理可以滿足辣椒生長后期養(yǎng)分需求。而對于NH⁺₄-N含量而言，揚花期NB、NPB處理的土壤NH⁺₄-N含量分別比NN處理高81.93%、136.83%。

2.4生物炭與根際促生菌配施對土壤氮代謝酶活性的影響

由圖3-A可知，土壤脲酶（UE）活性指標中，各處理表現(xiàn)為CK＜PB＜NP

2.5生物炭與根際促生菌配施對土壤氮功能菌絕對豐度的影響

由圖4-A可知，硝化螺旋菌屬（Nitrospira）絕對豐度中，各處理高低表現(xiàn)為CK＜NN＜NB＜NP

2.6土壤氮指標與辣椒植株氮素指標間的相關性分析

由表2可知，土壤硝態(tài)氮（NO-3-N）、土壤銨態(tài)氮（NH+4-N）含量與植株根系氮、莖稈氮、葉部氮、辣椒果實氮含量及氮總量、產(chǎn)量、氮素利用率均存在極顯著正相關關系（P<0.01）。土壤脲酶（UE）、硝酸還原酶（NR）活性與植株根系氮、莖稈氮、辣椒果實氮含量及氮總量、產(chǎn)量、氮素利用率均存在極顯著或顯著正相關關系。土壤過氧化氫酶（CAT）活性與植株根系氮、莖稈氮、葉部氮、辣椒果實氮含量及氮總量、產(chǎn)量、氮素利用率存在極顯著或顯著負相關關系。土壤中性蛋白酶（NTP）活性與植株根系氮、莖稈氮、辣椒果實氮含量及氮總量、產(chǎn)量、氮素利用率存在極顯著或顯著負相關關系。

3討論與結論

根際促生菌（PGPR）是植物根際重要的微生物組成部分，可通過活化養(yǎng)分、分泌抗生素及誘導植物激素合成等方式促進植物生長發(fā)育，現(xiàn)已成為農林業(yè)可持續(xù)化發(fā)展的重要研究領域［7，16］。氮素是葉綠素和有機大分子的重要組成部分，其含量與葉片光合作用和產(chǎn)量密切相關［17］。本研究中，辣椒植株根系、莖稈、葉部、辣椒果實中氮含量均以NB、NPB處理較高；在總氮素含量中，PB處理低于CK處理，且NP處理小于NN處理。許多研究表明，PGPR可促進室內植物生長并增強植物對各種疾病和非生物脅迫的抵抗力，而在田間條件下PGPR效果較差，這通常是由于微生物在根際土壤或植物內胚層中的定殖不足所致［18］。本研究中，植物各器官及總氮素累積量均以NPB處理最高，均顯著高于CK、PB、NN處理。大量研究表明，生物炭可通過改善土壤結構而進一步改善土壤孔隙度和通氣性，為PGPR在土壤中定殖提供生態(tài)位［10］， 而高pH值的生物炭以調節(jié)酸性土壤的酸堿度［19］，這可能是生物炭和PGPR聯(lián)合應用可以促進植株氮素累積的重要原因之一。

本研究中，氮素配施生物炭處理（NB）時，辣椒產(chǎn)量比常規(guī)施氮（NN）顯著提高2.99%，表明生物炭對辣椒產(chǎn)量的形成有積極作用。這一結果與前人的研究結果基本一致，即應用生物炭可以改善植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量收獲［20］。然而，氮素配施促生菌處理（NP）使得產(chǎn)量顯著降低4.35%。申佳麗等的研究表明，常規(guī)施肥下，不同PGPR菌株均對黃瓜幼苗生長發(fā)育及土壤根際環(huán)境具有積極影響，其中枯草芽孢桿菌（B. subtilis）可顯著提高黃瓜產(chǎn)量［21］。本研究結論與之存在差異，兩者差異可能與植物種類不同、土著微生物的競爭以及不利的土壤環(huán)境因素有關［18］，從而影響PGPR的繁殖和活性，使其效果不穩(wěn)定，甚至導致土壤微生物的功能因競爭受損［4］。生物炭與PGPR結合處理，顯著提高了干椒產(chǎn)量，NPB處理分別比NN、NP、NB處理高9.13%、14.10%、5.97%，表明生物炭和PGPR的聯(lián)合應用具有疊加效應。這可能是由于生物炭具有多孔結構，其豐富的孔隙為微生物提供了可以抵御其他生物入侵的棲息地［22］。

土壤酶系統(tǒng)代表了土壤生物的代謝能力，可以催化土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生化過程，也可表征土壤的生態(tài)功能和土壤養(yǎng)分轉化過程的強度和方向［23-24］。土壤微生物群落的變化也會影響土壤酶活性，部分微生物可介導胞外酶活性。土壤脲酶（UE）、中性蛋白酶（NTP）活性通常與土壤微生物的數(shù)量有關［25］，并且隨著有機質含量的增加而增強［26］。本研究中，與常規(guī)施肥（NN）處理相比，單獨施用生物炭（NB）處理使UE、NTP活性分別提高了17.20%、25.51%，而與PGPR結合（NPB）使用時分別提高了34.41%、48.77%，表明施用生物炭可以提高土壤微生物群落數(shù)量和酶活性，生物炭與PGPR聯(lián)合施用可以產(chǎn)生更顯著的協(xié)同效應。

本研究中，土壤脲酶（UE）、中性蛋白酶（NTP）活性提高，而過氧化氫酶（CAT）、硝酸還原酶（NR）活性降低，這可導致土壤中NH+4-N與NO-3-N間發(fā)生轉換，從而調節(jié)辣椒各生育期土壤可利用氮的供應。NPB、NB處理顯著提高了辣椒揚花期—坐果期土壤NH+4-N的含量，且PGPR與生物炭的應用增加了土壤中硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的豐度。高豐度的固氮菌群有利于微生物生態(tài)位分化及非共生固氮，螺旋亞硝酸鹽序列簇細菌群落對高氨環(huán)境迅速反應，從而促進硝化作用，增加土壤中亞硝酸鹽和NO-3-N的含量［27］。此外，成熟期NPB處理的土壤NO-3-N含量均明顯大于NN、NP、NB處理。肥料利用效率主要取決于作物對養(yǎng)分的吸收能力以及土壤和肥料養(yǎng)分的供給能力［28］。本研究中，NPB處理的氮素利用率（NUE）分別比NN、NP、NB處理增加6.57、9.52、3.37百分點。綜上，生物炭和PGPR的聯(lián)合施用，增加了辣椒根際土壤中氮功能菌的絕對豐度，調控了與N轉化相關的土壤酶活性，促進了N的轉化和循環(huán)，增加了土壤N的有效性，提高了辣椒植株對N的吸收累積，從而提升了植物的氮素利用率。

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